| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7页 |
| 英文缩略表 | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-16页 |
| 1.1 普鲁兰酶简介 | 第9页 |
| 1.2 普鲁兰酶基因工程最新研究进展 | 第9-12页 |
| 1.2.1 大肠杆菌系统的异源表达 | 第9-11页 |
| 1.2.2 普鲁兰酶蛋白的分子改良 | 第11-12页 |
| 1.3 普鲁兰酶在食品工业中的应用 | 第12-14页 |
| 1.3.1 普鲁兰酶在高葡萄糖浆生产中的应用 | 第12页 |
| 1.3.2 普鲁兰酶在超高麦芽糖浆生产中的应用 | 第12-13页 |
| 1.3.3 普鲁兰酶在啤酒酿造工业中的应用 | 第13页 |
| 1.3.4 普鲁兰酶在改性淀粉食品生产中的应用 | 第13-14页 |
| 1.4 热稳定性的研究 | 第14页 |
| 1.5 研究目的及意义 | 第14页 |
| 1.6 本文的研究内容 | 第14-15页 |
| 1.7 本实验的技术路线 | 第15-16页 |
| 第二章 普鲁兰酶的截短突变研究 | 第16-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第16-20页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第16页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第16-17页 |
| 2.1.3 工具酶、引物、试剂盒及生化试剂 | 第17页 |
| 2.1.4 相关溶液 | 第17-19页 |
| 2.1.5 培养基 | 第19页 |
| 2.1.6 大肠杆菌感受态细胞mach1-t1的制备 | 第19-20页 |
| 2.1.7 其他 | 第20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-29页 |
| 2.2.1 普鲁兰酶基因的克隆及大肠杆菌表达载体的构建 | 第20-23页 |
| 2.2.1.1 Bacillus naganoensis (ATCC53909)细菌总DNA基因组的提取 | 第20-21页 |
| 2.2.1.2 PCR克隆普鲁兰酶基因片段 | 第21页 |
| 2.2.1.3 克隆质粒pGM-T-Pul的构建与基因测序 | 第21-23页 |
| 2.2.1.4 重组表达质粒pET22b-Pul的构建与鉴定 | 第23页 |
| 2.2.2 普鲁兰酶基因截短位置的确定 | 第23-24页 |
| 2.2.3 普鲁兰酶截短突变体的克隆及大肠杆菌表达载体的构建 | 第24-26页 |
| 2.2.3.1 PCR克隆普鲁兰酶截短突变体基因片段 | 第24页 |
| 2.2.3.2 截短突变体重组表达质粒的构建与鉴定 | 第24-26页 |
| 2.2.4 普鲁兰酶基因及截短基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.4.1 普鲁兰酶基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第26-27页 |
| 2.2.4.2 普鲁兰酶截短基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第27页 |
| 2.2.4.3 SDS-PAGE电泳检测 | 第27页 |
| 2.2.5 葡萄糖标准曲线制作 | 第27-28页 |
| 2.2.6 普鲁兰酶的酶活性测定方法 | 第28页 |
| 2.2.7 重组普鲁兰酶突变体的酶学性质测定 | 第28-29页 |
| 2.2.7.1 最适温度和热稳定性 | 第28-29页 |
| 2.2.7.2 最适pH值 | 第29页 |
| 2.3 结果与分析 | 第29-38页 |
| 2.3.1 细菌总DNA提取 | 第29-30页 |
| 2.3.2 普鲁兰酶基因截短位置的确定 | 第30-31页 |
| 2.3.3 重组酶表达载体的构建 | 第31-33页 |
| 2.3.4 重组表达质粒的酶切验证 | 第33-34页 |
| 2.3.5 原酶及截短突变体Pul-D1F在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第34-35页 |
| 2.3.6 截短突变体Pul-D2F、Pul-D3F和Pul-D4R在大肠杆菌中的诱导表达 | 第35-36页 |
| 2.3.7 重组普鲁兰酶基因的酶活性测定 | 第36-38页 |
| 2.3.7.1 最适pH | 第36-37页 |
| 2.3.7.2 最适温度 | 第37-38页 |
| 2.4 小结 | 第38-39页 |
| 第三章 普鲁兰酶的热稳定性突变研究 | 第39-52页 |
| 3.1 实验材料 | 第39-40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-42页 |
| 3.2.1 突变位点的选择 | 第40页 |
| 3.2.2 单点突变及多点突变体的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.2.1 重组PCR扩增引入突变位点 | 第40页 |
| 3.2.2.2 PCR扩增，得到片段F和片段R | 第40-41页 |
| 3.2.2.3 将纯化后的两个片段用重组酶体外重组 | 第41页 |
| 3.2.2.4 将重组片段转化大肠杆菌 | 第41页 |
| 3.2.3 突变体在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第41-42页 |
| 3.2.4 突变体的酶学性质测定 | 第42页 |
| 3.2.4.1 突变酶的最适温度及热稳定性测定 | 第42页 |
| 3.2.4.2 突变酶的最适pH | 第42页 |
| 3.3 结果与分析 | 第42-51页 |
| 3.3.1 突变位点的选择 | 第42-45页 |
| 3.3.2 突变酶重组质粒载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.3 重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)后的酶切验证 | 第46-47页 |
| 3.3.4 突变体的诱导及纯化 | 第47-48页 |
| 3.3.5 突变体的酶学性质测定 | 第48-51页 |
| 3.3.5.1 突变酶的最适温度 | 第48-49页 |
| 3.3.5.2 突变酶的最适pH | 第49页 |
| 3.3.5.3 突变酶的热稳定性 | 第49-51页 |
| 3.4 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 全文结论 | 第52-53页 |
| 4.1 结论 | 第52页 |
| 4.2 后续工作 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 在校期间科研成果 | 第57页 |
