| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文缩略表 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-18页 |
| 1.1 GlnR调控因子 | 第11-13页 |
| 1.1.1 GlnR调控因子简介 | 第11页 |
| 1.1.2 GlnR调控因子对氮源的调控作用 | 第11-13页 |
| 1.2 亚硝酸还原酶 | 第13-14页 |
| 1.2.1 亚硝酸盐的来源与危害 | 第13页 |
| 1.2.2 亚硝酸还原酶的分类 | 第13-14页 |
| 1.3 植物乳杆菌 | 第14-16页 |
| 1.3.1 植物乳杆菌的介绍 | 第14-15页 |
| 1.3.2 植物乳杆菌的应用 | 第15-16页 |
| 1.3.3 植物乳杆菌与亚硝酸盐的关系 | 第16页 |
| 1.4 课题出处、研究目的和意义 | 第16-18页 |
| 1.4.1 本课题出处 | 第16页 |
| 1.4.2 论文研究的目的和意义 | 第16-18页 |
| 第二章 凝胶阻滞验证GlnR蛋白与NiR有相互作用 | 第18-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 仪器 | 第18页 |
| 2.1.3 主要培养基和试剂 | 第18-20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-32页 |
| 2.2.1 PCR扩增GlnR基因 | 第20-21页 |
| 2.2.2 T3-GlnR克隆载体的构建 | 第21-23页 |
| 2.2.3 重组表达载体pPIC9-GlnR和pET30a-GlnR的构建 | 第23-25页 |
| 2.2.4 .GlnR的毕赤酵母表达与纯化 | 第25-26页 |
| 2.2.5 SDS-PAGE分析重组载体pPIC9-GlnR的表达产物 | 第26-27页 |
| 2.2.6 GlnR蛋白的大肠诱导表达和纯化 | 第27-28页 |
| 2.2.7 .SDS-PAGE分析GlnR蛋白 | 第28页 |
| 2.2.8 凝胶阻滞分析GlnR蛋白与Pnir互作 | 第28-32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-37页 |
| 2.3.1 PCR扩增GlnR基因 | 第32-34页 |
| 2.3.2 pPIC9-GlnR表达载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析重组载体pPIC9-GlnR的表达产物 | 第35页 |
| 2.3.4 pET30a-GlnR表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.3.5 GlnR蛋白的诱导表达与纯化 | 第36页 |
| 2.3.6 GlnR蛋白与亚硝酸还原酶NiR的相互作用 | 第36-37页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第37-39页 |
| 第三章 利用酵母双杂交和qRT-PCR研究GlnR与NiR的相互作用与调控机制 | 第39-51页 |
| 3.1 材料和方法 | 第39-40页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第39页 |
| 3.1.2 试剂和工具酶 | 第39页 |
| 3.1.3 培养基的配制 | 第39-40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-45页 |
| 3.2.1 GlnR和NiR基因的克隆 | 第40-41页 |
| 3.2.2 GlnR-pGBKT7诱饵载体和报告载体NiR-pGADT7的构建 | 第41-42页 |
| 3.2.3 融合载体对宿主细胞毒性及自激活的检测 | 第42-44页 |
| 3.2.4 亚硝酸还原酶NiR和GlnR蛋白的酵母双杂交 | 第44页 |
| 3.2.5 L.plantarumWU14总RNA的提取 | 第44页 |
| 3.2.6 荧光定量RT-PCR | 第44-45页 |
| 3.3 结果与分析 | 第45-49页 |
| 3.3.1 亚硝酸还原酶(NiR)和GlnR基因的克隆 | 第45页 |
| 3.3.2 GlnR-pGBKT7诱饵载体和报告载体NiR-pGADT7的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.3 菌落PCR检测重组载体pAD-NiR和pBD-GlnR | 第46页 |
| 3.3.4 融合载体的自激活和毒性检测 | 第46-47页 |
| 3.3.5 亚硝酸还原酶(NiR)和调控蛋白GlnR相互作用分析 | 第47-48页 |
| 3.3.6 L.plantarumWU14RNA的提取 | 第48-49页 |
| 3.3.7 qRT-PCR分析GlnR与NiR基因转录调控机制 | 第49页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第49-51页 |
| 第四章 NiR的基因敲除 | 第51-66页 |
| 4.1 材料和方法 | 第51页 |
| 4.1.1 质粒 | 第51页 |
| 4.1.2 工具酶及器材 | 第51页 |
| 4.1.3 主要培养基和试剂 | 第51页 |
| 4.2 实验方法 | 第51-58页 |
| 4.2.1 L.plantarumWU14基因组的提取 | 第51-52页 |
| 4.2.2 基因敲除克隆载体的构建 | 第52-55页 |
| 4.2.3 .连接产物的转化 | 第55页 |
| 4.2.4 .菌落PCR检测重组载体T3/Nir5’-kan-Nir3’ | 第55页 |
| 4.2.5 基因敲除载体pSUP202-Nir5’-kan-Nir3’的构建 | 第55-57页 |
| 4.2.6 L.plantarumWU14感受态的制备及重组质粒的电转 | 第57-58页 |
| 4.2.7 L.plantarumWU14的第一轮菌落PCR分析 | 第58页 |
| 4.2.8 L.plantarumWU14的第二轮菌落PCR分析 | 第58页 |
| 4.3 结果和分析 | 第58-65页 |
| 4.3.1 L.plantarumWU14基因组的提取 | 第58-59页 |
| 4.3.2 亚硝酸还原酶上游同源臂Nir5’及Kan抗性基因的扩增 | 第59页 |
| 4.3.3 NiR上游同源臂与Kan的PCR连接(NiR5’-Kan) | 第59-60页 |
| 4.3.4 NiR下游同源臂与NiR5’-Kan的PCR连接 | 第60页 |
| 4.3.5 基因敲除载体pSUP202-Nir5’-kan-Nir3’的构建 | 第60-63页 |
| 4.3.6 .菌落PCR验证重组质粒 | 第63页 |
| 4.3.7 植物乳杆菌基因组的提取 | 第63-64页 |
| 4.3.8 L.plantarumWU14的第一代菌落PCR验证 | 第64-65页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第65-66页 |
| 第五章 全文总结及展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 作者简历 | 第74-75页 |
| 附录 | 第75页 |
