| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-30页 |
| ·燃料乙醇概述 | 第12-14页 |
| ·燃料乙醇是优良的可再生能源 | 第12-13页 |
| ·木薯是重要的非粮生物燃料乙醇原料 | 第13-14页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第14-20页 |
| ·酿酒酵母遗传工程 | 第14-15页 |
| ·拓展酵母的底物利用范围 | 第14-15页 |
| ·增加酵母对营养物质的利用 | 第15页 |
| ·基因敲除 | 第15页 |
| ·存在问题 | 第15页 |
| ·表达载体 | 第15-16页 |
| ·整合型载体(yeast intergration plasmid,YIp) | 第15-16页 |
| ·附加型载体(yeast episomal plasmid,YEp) | 第16页 |
| ·酿酒酵母表达载体展望 | 第16页 |
| ·启动子 | 第16-17页 |
| ·信号肽 | 第17页 |
| ·筛选标记 | 第17-18页 |
| ·转化方法 | 第18-19页 |
| ·多拷贝策略——rDNA整合 | 第19-20页 |
| ·多基因转化策略改善生物遗传性状 | 第20-21页 |
| ·多个表达载体多次转化法 | 第20页 |
| ·多个表达载体共转化法 | 第20页 |
| ·多基因单表达载体一次转化法 | 第20-21页 |
| ·酒精发酵原理与工艺 | 第21-25页 |
| ·原理 | 第21页 |
| ·淀粉质基质酒精发酵工艺 | 第21-25页 |
| ·蒸煮糊化 | 第22-23页 |
| ·液化与糖化 | 第23-24页 |
| ·酒精发酵 | 第24页 |
| ·同步糖化发酵与先糖化后发酵 | 第24-25页 |
| ·纤维素酶 | 第25-27页 |
| ·内切葡聚糖酶Ⅲ | 第26-27页 |
| ·外切葡聚糖苷酶 | 第27页 |
| ·β-葡萄糖苷酶Ⅰ | 第27页 |
| ·葡萄糖淀粉酶Ⅰ | 第27-28页 |
| ·木薯乙醇发酵中亟待解决的关键问题 | 第28页 |
| ·本论文的研究内容 | 第28-30页 |
| 第二章 材料与方法 | 第30-56页 |
| ·实验材料 | 第30-36页 |
| ·菌株和质粒 | 第30-31页 |
| ·引物 | 第31-34页 |
| ·仪器与设备 | 第34页 |
| ·试剂与工具酶 | 第34-35页 |
| ·培养基 | 第35-36页 |
| ·实验方法 | 第36-56页 |
| ·技术路线 | 第36-37页 |
| ·常规试剂配置 | 第37页 |
| ·真菌总RNA提取 | 第37-38页 |
| ·酵母基因组DNA提取 | 第38-39页 |
| ·基因克隆及重组质粒PCR鉴定 | 第39-42页 |
| ·PCR体系 | 第39-40页 |
| ·PCR扩增条件 | 第40-42页 |
| ·连接 | 第42-43页 |
| ·大肠杆菌转化方法 | 第43页 |
| ·E.coli质粒提取 | 第43-44页 |
| ·酵母感受态制备 | 第44-45页 |
| ·酵母电转化 | 第45页 |
| ·酵母转化子铜抗性筛选方法的建立 | 第45页 |
| ·酵母转化子PCR鉴定 | 第45-46页 |
| ·酵母转化子分泌表达酶的定性鉴定 | 第46页 |
| ·酶活测定 | 第46-47页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第47-48页 |
| ·酶蛋白制备——三氯醋酸沉淀法 | 第47页 |
| ·重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定 | 第47-48页 |
| ·葡萄糖淀粉酶基因ga1的RT-PCR | 第48页 |
| ·葡萄糖淀粉酶基因ga1点突变 | 第48-49页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳及其DNA片段回收 | 第49页 |
| ·pYES2M Sph Ⅰ位点去除 | 第49-51页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第51-54页 |
| ·酒精发酵 | 第54-55页 |
| ·成分测定 | 第55-56页 |
| 第三章 整合型表达载体pYES2M的构建 | 第56-70页 |
| ·信号肽a-MF基因克隆 | 第56-58页 |
| ·启动子Ppgk基因克隆 | 第58-60页 |
| ·rDNA基因克隆 | 第60-61页 |
| ·CUP1基因克隆 | 第61-63页 |
| ·整合型表达载体pYES2M的构建 | 第63-69页 |
| ·启动子Ppgk与pYES2连接 | 第63页 |
| ·信号肽α-MF与pYES2-Ppgk连接 | 第63-65页 |
| ·rDNA与pYES2-PMF连接 | 第65-67页 |
| ·抗铜蛋白基因CUP1与pYES2-PMF-rDNA连接 | 第67-68页 |
| ·点突变去除pYES2M多克隆位点Sph Ⅰ位点 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 第四章 酿酒酵母转化子筛选方法的建立 | 第70-76页 |
| ·酿酒酵母转化子筛选方法的建立——铜抗性标记法 | 第70-71页 |
| ·酿酒酵母快速菌落PCR鉴定方法的建立 | 第71-75页 |
| ·不同破壁方法处理后酵母菌落PCR结果 | 第71-72页 |
| ·微珠涡旋法破壁效果的验证 | 第72-73页 |
| ·SDS法的验证与SDS-微珠法菌落PCR结果 | 第73-74页 |
| ·菌落PCR体系中破壁产物体积的确定 | 第74-75页 |
| ·本章小结 | 第75-76页 |
| 第五章 葡萄糖淀粉酶、葡聚糖内切酶和β-葡萄糖苷酶基因的克隆 | 第76-86页 |
| ·泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶基因ga1的克隆 | 第76-79页 |
| ·ga1的克隆 | 第76-78页 |
| ·ga1点突变 | 第78-79页 |
| ·里氏木霉葡聚糖内切酶基因eg3的克隆 | 第79-82页 |
| ·eg3的克隆 | 第79-81页 |
| ·eg3内含子的去除 | 第81-82页 |
| ·绿色木霉β-葡萄糖苷酶基因bgI1的克隆 | 第82-84页 |
| ·bgI1基因克隆 | 第82-83页 |
| ·bgI1内含子去除 | 第83-84页 |
| ·本章小结 | 第84-86页 |
| 第六章 多基因整合型表达载体的构建及其在工业酿酒酵母中的共表达 | 第86-110页 |
| ·单价载体pYES2M-ga1的构建、对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第86-89页 |
| ·表达载体pYES2M-ga1的构建 | 第86-87页 |
| ·重组载体pYES2M-ga1对酿酒酵母的转化及转化子PCR鉴定与功能鉴定 | 第87-89页 |
| ·单价载体pYES2M-ga1的构建、对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第89-91页 |
| ·表达载体pYES2M-eg3的构建 | 第89-90页 |
| ·pYES2M-eg3转化酿酒酵母及转化子鉴定 | 第90-91页 |
| ·单价载体pYES2M-bgI1的构建、对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第91-94页 |
| ·表达载体pYES2M-bgI1的构建 | 第91-93页 |
| ·pYES2M-bgI1对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第93-94页 |
| ·双价载体pYES2M-eg3-ga1的构建、对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第94-99页 |
| ·表达载体pYES2M-eg3-ga1的构建 | 第94-99页 |
| ·pYES2M-eg3-ga1对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第99页 |
| ·双价载体pYES2M-eg3-bgI1的构建、对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第99-103页 |
| ·扩增PMFbgI1片段 | 第99-101页 |
| ·表达载体pYES2M-eg3-bgI1的构建 | 第101-102页 |
| ·pYES2M-eg3-bgI1对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第102-103页 |
| ·三价载体pYES2M-eg3-ga1-bgI1的构建、对酿酒酵母的转化和鉴定 | 第103-107页 |
| ·表达载体pYES2M-eg3-ga1-bgI1的构建 | 第103-107页 |
| ·pYES2M-eg3-ga1-bgI1转化酿酒酵母与转化子的鉴定 | 第107页 |
| ·pYES2M转化NY-K及转化子鉴定 | 第107-108页 |
| ·本章小结 | 第108-110页 |
| 第七章 重组工业酿酒酵母对纯底物和粗木薯粉的酒精发酵 | 第110-120页 |
| ·重组酶SDS-PAGE凝胶电泳 | 第110-111页 |
| ·重组葡萄糖淀粉酶的酶学特征 | 第111-112页 |
| ·重组葡萄糖淀粉酶(GAI)酶活测定 | 第111页 |
| ·GAⅠ最适温度、pH测定 | 第111-112页 |
| ·GAⅠ最适温度和pH验证 | 第112页 |
| ·重组葡聚糖内切酶的酶学特征 | 第112-113页 |
| ·重组葡葡聚糖内切酶(EGⅢ)酶活测定 | 第112页 |
| ·EGⅢ最适温度、pH测定 | 第112-113页 |
| ·EGⅢ最适温度和pH验证 | 第113页 |
| ·重组β-葡萄糖苷酶的酶学特征 | 第113-115页 |
| ·重组β-葡萄糖苷酶(BGLⅠ)酶活测定 | 第113-114页 |
| ·BGLⅠ最适温度、pH测定 | 第114页 |
| ·BGLⅠ最适温度和pH验证 | 第114-115页 |
| ·重组酿酒酵母对纯底物的酒精发酵 | 第115-116页 |
| ·重组酿酒酵母对可溶性淀粉的酒精发酵 | 第115页 |
| ·重组酿酒酵母对羧甲基纤维素的酒精发酵 | 第115-116页 |
| ·重组酿酒酵母对纤维二糖的酒精发酵 | 第116页 |
| ·重组酿酒酵母对粗木薯粉的酒精发酵 | 第116-119页 |
| ·不添加酶制剂时重组酿酒酵母对粗木薯粉的酒精发酵 | 第116-117页 |
| ·添加酶制剂时重组酿酒酵母对粗木薯粉的酒精发酵 | 第117-118页 |
| ·重组酿酒酵母NY-K/pYES2M-eg3-ga1-bI1对木薯粉的酒精发酵——SSF和SHF | 第118-119页 |
| ·本章小结 | 第119-120页 |
| 第八章 结论与展望 | 第120-124页 |
| 主要研究结论 | 第120-121页 |
| 论文创新点 | 第121-122页 |
| 展望 | 第122-124页 |
| 参考文献 | 第124-132页 |
| 论文发表 | 第132-133页 |
| 附录1 整合型载体pYES2M构建示意图 | 第133-137页 |
| 附录2 单价载体构建示意图 | 第137-140页 |
| 附录3 双价载体pYES2M-eg3-ga1建示意图 | 第140-143页 |
| 附录4 双价载体pYES2M-eg3-bgI1构建示意图 | 第143-144页 |
| 附录5 三价载体pYES2M-eg3-ga1-bgI1构建示意图 | 第144-145页 |
| 附录6 Ppgk在GenBank登陆号(FJ415226)与内容 | 第145-147页 |
| 附录7 Ppgk测序结果 | 第147页 |
| 附录8 α-MF测序结果 | 第147页 |
| 附录9 rDNA测序结果 | 第147-148页 |
| 附录10 CUP1测序结果 | 第148-149页 |
| 附录11 ga1测序结果 | 第149-150页 |
| 附录12 eg3测序结果 | 第150页 |
| 附录13 bgI1测序结果 | 第150-152页 |
| 附录14 英文缩写(Abbreviation) | 第152-153页 |
| 致谢 | 第153页 |
