| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 中英文缩写词对照表 | 第8-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-24页 |
| 1.1 低温微生物和低温酶 | 第13页 |
| 1.1.1 低温微生物的分布 | 第13页 |
| 1.1.2 低温微生物与低温酶 | 第13页 |
| 1.2 低温 β-半乳糖苷酶 | 第13-17页 |
| 1.2.1 β-半乳糖苷酶 | 第13-14页 |
| 1.2.2 β-半乳糖苷酶的研究现状 | 第14-15页 |
| 1.2.3 低温 β-半乳糖苷酶的微生物来源及外源表达 | 第15-16页 |
| 1.2.4 低温 β-半乳糖苷酶固定化 | 第16-17页 |
| 1.3 蛋白质的结构研究 | 第17-20页 |
| 1.3.1 蛋白质结晶原理及技术 | 第17-18页 |
| 1.3.2 蛋白质晶体衍射 | 第18页 |
| 1.3.3 蛋白质晶体结构的解析 | 第18-19页 |
| 1.3.4 低温酶的晶体结构 | 第19-20页 |
| 1.4 β-半乳糖苷酶结构特点 | 第20-22页 |
| 1.4.1 结构特点 | 第20页 |
| 1.4.2 催化结构域 | 第20-21页 |
| 1.4.3 热稳定性 | 第21-22页 |
| 1.5 立题依据与研究意义 | 第22-23页 |
| 1.6 主要研究内容 | 第23-24页 |
| 第二章 Rahnella sp. R3低温 β-半乳糖苷酶基因的克隆表达 | 第24-48页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 材料与设备 | 第24-27页 |
| 2.2.1 菌株及质粒 | 第24-25页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第25页 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 | 第25-26页 |
| 2.2.4 培养基 | 第26-27页 |
| 2.2.5 主要溶液 | 第27页 |
| 2.2.6 数据库与软件 | 第27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-37页 |
| 2.3.1 Rahnella sp. R3基因组DNA的分离 | 第27页 |
| 2.3.2 R3-bgal基因片段的扩增 | 第27-30页 |
| 2.3.3 基因全长的扩增 | 第30-31页 |
| 2.3.4 表达载体构建和转化 | 第31-35页 |
| 2.3.5 诱导条件优化 | 第35-36页 |
| 2.3.6 β-半乳糖苷酶活力的测定 | 第36-37页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第37-47页 |
| 2.4.1 氨基酸序列比对与引物设计 | 第37页 |
| 2.4.2 R3-bgal基因片段扩增 | 第37-38页 |
| 2.4.3 R3-bgal的全长扩增 | 第38页 |
| 2.4.4 R3-bgal序列生物信息学分析 | 第38-41页 |
| 2.4.5 表达载体的构建 | 第41-43页 |
| 2.4.6 转化、阳性克隆的筛选及鉴定 | 第43页 |
| 2.4.7 重组蛋白质的诱导表达 | 第43-47页 |
| 2.5 本章小结 | 第47-48页 |
| 第三章 重组低温 β-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 | 第48-61页 |
| 3.1 前言 | 第48页 |
| 3.2 材料与设备 | 第48-49页 |
| 3.2.1 菌株 | 第48页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第48-49页 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 | 第49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-51页 |
| 3.3.1 重组低温 β-半乳糖苷酶的分离纯化 | 第49-50页 |
| 3.3.2 SDS-PAGE电泳鉴定 | 第50页 |
| 3.3.3 β-半乳糖苷酶活力的测定 | 第50页 |
| 3.3.4 R3-bgal 酶学性质分析 | 第50-51页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第51-60页 |
| 3.4.1 重组酶的分离纯化 | 第51-53页 |
| 3.4.2 R3-bgal相对分子量的测定 | 第53页 |
| 3.4.3 R3-bgal的最适作用温度和最适作用pH | 第53-55页 |
| 3.4.4 R3-bgal的热稳定性 | 第55页 |
| 3.4.5 金属离子对R3-bgal的活性及二级结构的影响 | 第55-57页 |
| 3.4.6 温度和pH对R3-bgal二级结构的影响 | 第57-58页 |
| 3.4.7 R3-bgal米氏动力学 | 第58-59页 |
| 3.4.8 R3-bgal反应抑制动力学 | 第59-60页 |
| 3.5 本章小结 | 第60-61页 |
| 第四章 Rahnella sp. R3低温 β-半乳糖苷酶的结晶及晶体结构解析 | 第61-74页 |
| 4.1 前言 | 第61页 |
| 4.2 材料与设备 | 第61-62页 |
| 4.2.1 菌株及质粒 | 第61-62页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第62页 |
| 4.2.3 主要仪器和设备 | 第62页 |
| 4.2.4 软件和在线分析网站 | 第62页 |
| 4.3 实验方法 | 第62-66页 |
| 4.3.1 蛋白质分离纯化 | 第62-63页 |
| 4.3.2 晶体生长条件初筛 | 第63页 |
| 4.3.3 晶体生长条件优化 | 第63页 |
| 4.3.4 X射线晶体衍射数据收集与处理 | 第63-64页 |
| 4.3.5 晶体结构解析 | 第64-65页 |
| 4.3.6 定点突变 | 第65-66页 |
| 4.3.7 突变酶的表达、分离和纯化 | 第66页 |
| 4.3.8 突变酶的二级结构 | 第66页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第66-73页 |
| 4.4.1 蛋白质的分离纯化 | 第66-67页 |
| 4.4.2 R3-bgal结晶条件筛选及优化 | 第67-68页 |
| 4.4.3 R3-bgal结晶数据收集与处理 | 第68-69页 |
| 4.4.4 R3-bgal晶体模型构建和精修 | 第69-70页 |
| 4.4.5 R3-bgal三维结构 | 第70-71页 |
| 4.4.6 催化位点验证 | 第71-73页 |
| 4.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 第五章 R3-bgal结构域分析及耐冷机制 | 第74-85页 |
| 5.1 前言 | 第74页 |
| 5.2 材料与设备 | 第74-75页 |
| 5.2.1 菌株及质粒 | 第74页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第74页 |
| 5.2.3 主要仪器和设备 | 第74页 |
| 5.2.4 软件和在线分析网站 | 第74-75页 |
| 5.3 实验方法 | 第75-76页 |
| 5.3.1 引物设计 | 第75页 |
| 5.3.2 PCR反应体系和程序 | 第75页 |
| 5.3.3 目的片段与表达载体的连接 | 第75-76页 |
| 5.3.4 重组质粒的转化和表达 | 第76页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第76-83页 |
| 5.4.1 R3-bgal结构域及结构域功能 | 第76-80页 |
| 5.4.2 R3-bgal活性中心与功能 | 第80-81页 |
| 5.4.3 R3-bgal耐冷机制分析 | 第81-83页 |
| 5.5 本章小结 | 第83-85页 |
| 第六章 R3-bgal的微胶囊固定化 | 第85-98页 |
| 6.1 前言 | 第85页 |
| 6.2 材料与设备 | 第85-86页 |
| 6.2.1 主要试剂 | 第85-86页 |
| 6.2.2 主要仪器和设备 | 第86页 |
| 6.3 实验方法 | 第86-88页 |
| 6.3.1 R3-bgal的纯化及活性测定 | 第86页 |
| 6.3.2 结冷胶水凝胶的制备 | 第86页 |
| 6.3.3 温度、pH，金属离子的影响 | 第86页 |
| 6.3.4 固定化R3-bgal的反应动力学 | 第86-87页 |
| 6.3.5 结冷胶水凝胶的性质 | 第87页 |
| 6.3.6 结冷胶水凝胶表面和截面性质 | 第87页 |
| 6.3.7 固定化R3-bgal生产低乳糖牛乳 | 第87-88页 |
| 6.3.8 电子鼻分析 | 第88页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第88-96页 |
| 6.4.1 水凝胶珠的制备 | 第88-89页 |
| 6.4.2 pH、温度和金属离子对酶活性的影响 | 第89-91页 |
| 6.4.3 固定化酶的动力学参数 | 第91页 |
| 6.4.4 酶的包埋率和泄漏率 | 第91-92页 |
| 6.4.5 固定化酶的重复使用稳定性 | 第92-93页 |
| 6.4.6 凝胶珠的形态结构 | 第93-94页 |
| 6.4.7 固定化R3-bgal生产低乳糖牛乳 | 第94-95页 |
| 6.4.8 电子鼻对不同样品的分析 | 第95-96页 |
| 6.5 本章小结 | 第96-98页 |
| 论文主要结论与展望 | 第98-101页 |
| 主要结论 | 第98-99页 |
| 展望 | 第99-101页 |
| 论文创新点 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-114页 |
| 附录一：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第114-115页 |
| 附录二：PDB报告 | 第115-119页 |
| 附录三：氨基酸序列比对 | 第119-121页 |
