| 摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-30页 |
| 1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶概述 | 第18-19页 |
| 2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的结构和性质 | 第19-20页 |
| 3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株的诱变选育 | 第20-21页 |
| 4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达研究 | 第21-23页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆 | 第21-22页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的异源表达 | 第22-23页 |
| 5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的定向进化研究 | 第23-25页 |
| ·定向进化技术简介 | 第23页 |
| ·高通量筛选技术 | 第23-24页 |
| ·定向进化技术在β-1,3-1,4-葡聚糖酶改造中的应用 | 第24-25页 |
| 6 研究目的、意义及内容 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-30页 |
| 第二章 产β-1,3-1,4-葡聚糖酶高地芽孢杆菌YC-9理化诱变研究 | 第30-46页 |
| 1 材料和方法 | 第30-34页 |
| ·材料 | 第30-31页 |
| ·菌种 | 第30页 |
| ·培养基 | 第30-31页 |
| ·主要试剂 | 第31页 |
| ·主要仪器设备 | 第31页 |
| ·方法 | 第31-34页 |
| ·高地芽孢杆菌YC-9生长曲线及产β-1,3-1,4-葡聚糖酶动态曲线的测定 | 第31-32页 |
| ·高地芽孢杆菌YC-9的化学诱变 | 第32-33页 |
| ·低能矿束注入诱变 | 第33页 |
| ·遗传稳定性实验 | 第33页 |
| ·诱变菌株与原始菌株的生长产酶情况比较 | 第33-34页 |
| 2 结果与分析 | 第34-41页 |
| ·高地芽孢杆菌YC-9生长曲线及产β-1,3-1,4-葡聚糖酶动态曲线 | 第34-35页 |
| ·高地芽孢杆菌YC-9的化学诱变 | 第35-37页 |
| ·致死率和突变率 | 第35-36页 |
| ·高产菌株的筛选 | 第36-37页 |
| ·低能矿束注入诱变 | 第37-39页 |
| ·致死率 | 第37-38页 |
| ·高产菌株的筛选 | 第38-39页 |
| ·遗传稳定性实验 | 第39页 |
| ·诱变菌株与原始菌株的生长产酶情况比较 | 第39-41页 |
| 3 讨论 | 第41-42页 |
| 4 本章小结 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-46页 |
| 第三章 高地芽孢杆菌YC-9 β-1，3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达及重组酶性质研究 | 第46-74页 |
| 1 材料与方法 | 第46-54页 |
| ·材料 | 第46-47页 |
| ·菌株与质粒 | 第46页 |
| ·工具酶和相关试剂 | 第46-47页 |
| ·培养基与相关溶液 | 第47页 |
| ·主要仪器设备 | 第47页 |
| ·方法 | 第47-54页 |
| ·高地芽孢杆菌YC-9 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的扩增 | 第47-48页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆 | 第48页 |
| ·阳性克隆的筛选、鉴定与测序 | 第48-49页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第49-50页 |
| ·重组表达载体的筛选和鉴定 | 第50-51页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第51-52页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化 | 第52-53页 |
| ·重组酶的酶学性质研究 | 第53-54页 |
| 2 结果与分析 | 第54-69页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的扩增 | 第54页 |
| ·重组质粒pMD19-T-Glu的鉴定 | 第54-57页 |
| ·重组质粒pMD19-T-Glu的PCR鉴定 | 第54-55页 |
| ·重组质粒pMD19-T-Glu的双酶切鉴定 | 第55-56页 |
| ·目的片段测序和比对 | 第56-57页 |
| ·重组表达载体pET28a-Glu的鉴定 | 第57-59页 |
| ·重组表达载体pET28a-Glu的PCR鉴定 | 第57-58页 |
| ·重组表达载体pET28a-Glu的双酶切鉴定 | 第58页 |
| ·目的片段测序和比对 | 第58-59页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的诱导表达 | 第59-61页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第59页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第59-60页 |
| ·不同温度下β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的诱导表达情况 | 第60-61页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化 | 第61-65页 |
| ·硫酸铵分级沉淀 | 第61-62页 |
| ·DEAE-Sephacel阴离子交换柱层析 | 第62页 |
| ·Sephadex G-100凝胶过滤 | 第62-63页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测 | 第63-65页 |
| ·重组酶的酶学性质研究 | 第65-69页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应温度 | 第65页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性 | 第65-66页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应pH | 第66-67页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的pH稳定性 | 第67-68页 |
| ·金属离子对β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力的影响 | 第68页 |
| ·重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶促动力学研究 | 第68-69页 |
| 3 讨论 | 第69-70页 |
| 4 本章小结 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-74页 |
| 第四章 高地芽孢杆菌YC-9 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的定向进化研究 | 第74-104页 |
| 1 材料与方法 | 第74-81页 |
| ·材料 | 第74-75页 |
| ·菌株与质粒 | 第74页 |
| ·工具酶和相关试剂 | 第74-75页 |
| ·培养基与相关溶液 | 第75页 |
| ·主要仪器设备 | 第75页 |
| ·方法 | 第75-81页 |
| ·高通量筛选方法建立 | 第75-78页 |
| ·易错PCR反应体系中Mg~(2+)和Mn~(2+)浓度的优化 | 第78-80页 |
| ·含突变基因的克隆质粒文库的构建 | 第80页 |
| ·含突变基因的表达质粒文库的构建 | 第80页 |
| ·含突变基因表达文库的筛选 | 第80页 |
| ·摇瓶发酵时β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力的测定 | 第80页 |
| ·高酶活突变体的基因测序及氨基酸序列分析 | 第80页 |
| ·突变酶的纯化 | 第80-81页 |
| ·突变酶的酶学性质研究 | 第81页 |
| ·突变酶的三维结构同源模拟及突变位点分析 | 第81页 |
| 2 结果与分析 | 第81-100页 |
| ·高通量筛选方法的建立 | 第81-85页 |
| ·微孔板法筛选时培养方式的确定 | 第81-82页 |
| ·胞内酶提取方法的确定 | 第82-83页 |
| ·显色反应条件的确定 | 第83-84页 |
| ·高通量筛选流程图 | 第84-85页 |
| ·易错PCR反应体系中Mg~(2+)和Mn~(2+)浓度的优化 | 第85-89页 |
| ·Mg~(2+)浓度对PCR结果的影响 | 第85-86页 |
| ·Mn~(2+)浓度对PCR结果的影响 | 第86-87页 |
| ·不同Mg~(2+)和Mn~(2+)浓度组合后的PCR结果 | 第87-88页 |
| ·不同组合下的碱基突变数 | 第88-89页 |
| ·突变库的构建及筛选 | 第89-100页 |
| ·易错PCR扩增β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 | 第89-90页 |
| ·含突变基因克隆质粒的构建及双酶切 | 第90页 |
| ·含突变基因重组表达质粒的构建及双酶切 | 第90-91页 |
| ·突变基因表达文库的构建及筛选 | 第91-92页 |
| ·高酶活突变体的基因测序及氨基酸序列分析 | 第92-94页 |
| ·突变酶Glu-167的酶学性质研究 | 第94-97页 |
| ·突变酶Glu-167与原始酶性质比较 | 第97页 |
| ·突变酶Glu-167的三维结构同源模拟及突变位点分析 | 第97-100页 |
| 3 讨论 | 第100-101页 |
| 4 本章小结 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-104页 |
| 全文结论 | 第104-106页 |
| 论文创新点 | 第106-108页 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 | 第108-110页 |
| 致谢 | 第110页 |
