| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-19页 |
| 1 羧酸酯水解酶概述 | 第11-14页 |
| 1.1 羧酸酯酶简介 | 第11页 |
| 1.2 羧酸酯水解酶的分类 | 第11-12页 |
| 1.3 羧酸酯水解酶的立体结构 | 第12页 |
| 1.4 羧酸酯水解酶的催化机制 | 第12页 |
| 1.5 羧酸酯水解酶的特殊活性及其在工业中的应用 | 第12-14页 |
| 2 宏基因组学概论 | 第14-17页 |
| 2.1 宏基因组学的简单介绍 | 第14页 |
| 2.2 宏基因组文库的筛选方法 | 第14-15页 |
| 2.3 土壤宏基因组文库筛选新型酯解酶的国内外研究进展 | 第15-17页 |
| 3 本实验研究的技术路线 | 第17页 |
| 4 本实验研究的目的及意义 | 第17-19页 |
| 第二章 栗树林土壤宏基因组文库筛选新型羧酸酯酶基因 | 第19-29页 |
| 1 实验材料 | 第19-20页 |
| 1.1 样品来源 | 第19页 |
| 1.2 菌株与载体 | 第19页 |
| 1.3 培养基 | 第19页 |
| 1.4 酶及生化试剂 | 第19-20页 |
| 1.5 常用溶液配制 | 第20页 |
| 1.6 实验仪器 | 第20页 |
| 2 实验方法 | 第20-23页 |
| 2.1 栗树林土壤宏基因组文库羧酸酯酶的活性筛选 | 第20页 |
| 2.2 亚克隆产酯酶菌株的筛选 | 第20-23页 |
| 2.3 测序及序列分析 | 第23页 |
| 3 实验结果与分析 | 第23-28页 |
| 3.1 酯解酶活性克隆筛选及亚克隆 | 第23-24页 |
| 3.2 酯解酶活性亚克隆序列测定及分析 | 第24-28页 |
| 4 讨论 | 第28-29页 |
| 第三章 羧酸酯酶基因的原核异源表达 | 第29-39页 |
| 1 实验材料 | 第29-31页 |
| 1.1 菌株与载体 | 第29页 |
| 1.2 酶及生化试剂 | 第29页 |
| 1.3 常用溶液配制 | 第29-30页 |
| 1.4 实验仪器 | 第30-31页 |
| 2 实验方法 | 第31-34页 |
| 2.1 酯酶基因引物的设计与合成 | 第31页 |
| 2.2 酯酶基因的PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.3 克隆产物和表达载体的酶切及回收 | 第32页 |
| 2.4 重组表达载体的构建 | 第32页 |
| 2.5 E. coli BL21电转化感受态的制备及转化 | 第32-33页 |
| 2.6 酯酶重组子的筛选及鉴定 | 第33页 |
| 2.7 重组酯酶基因的诱导表达 | 第33页 |
| 2.8 重组酯酶的裂解及亲和层析纯化 | 第33-34页 |
| 2.9 重组酯酶的SDS-PAGE凝胶检测 | 第34页 |
| 2.10 Bradford试剂盒进行蛋白定量 | 第34页 |
| 3 实验结果与分析 | 第34-37页 |
| 3.1 酯酶基因的PCR扩增 | 第34-35页 |
| 3.2 克隆产物和表达载体的双酶切 | 第35页 |
| 3.3 酯酶重组子的鉴定 | 第35-36页 |
| 3.4 重组酯酶基因的诱导表达和亲和层析纯化 | 第36-37页 |
| 3.5 Bradford法测定EstGX2蛋白质量 | 第37页 |
| 4 讨论 | 第37-39页 |
| 第四章 重组羧酸酯酶EstGX2的酶学性质表征 | 第39-51页 |
| 1 实验材料 | 第39-40页 |
| 1.1 酶及化学试剂 | 第39页 |
| 1.2 常用溶液配制 | 第39-40页 |
| 1.3 实验仪器 | 第40页 |
| 2 实验方法 | 第40-42页 |
| 2.1 对硝基苯酚法测定酯酶活力的标准曲线 | 第40页 |
| 2.2 酯酶EstGX2的活力测定 | 第40-41页 |
| 2.3 酶促反应时间研究 | 第41页 |
| 2.4 EstGX2的底物特异性研究 | 第41页 |
| 2.5 EstGX2的动力学常数测定 | 第41页 |
| 2.6 不同温度对EstGX2活性及稳定性的影响 | 第41-42页 |
| 2.7 不同pH对EstGX2活性的影响 | 第42页 |
| 2.8 不同金属离子对EstGX2活性的影响 | 第42页 |
| 2.9 有机溶剂及表面活性剂对EstGX2酶活的影响 | 第42页 |
| 3 实验结果与分析 | 第42-49页 |
| 3.1 对硝基苯酚标准曲线 | 第42-43页 |
| 3.2 EstGX2的活力测定 | 第43页 |
| 3.3 EstGX2酶促反应时间的测定 | 第43-44页 |
| 3.4 EstGX2的底物特异性确定 | 第44-45页 |
| 3.5 EstGX2动力学常数的确定 | 第45-46页 |
| 3.6 EstGX2的最适温度及温度稳定性测定 | 第46-47页 |
| 3.7 EstGX2的最适pH测定 | 第47-48页 |
| 3.8 不同金属离子、有机溶剂及表面活性剂对EstGX2酶活影响的测定 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 总结与展望 | 第51-55页 |
| 1. 总结 | 第51-52页 |
| 2. 展望 | 第52-55页 |
| 参考文献 | 第55-63页 |
| 致谢 | 第63-65页 |
| 科研情况 发表论女 | 第65页 |
