| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第14-30页 |
| 1.1 亚硝酸盐的概述 | 第14-15页 |
| 1.2 亚硝酸盐的饮食来源 | 第15-17页 |
| 1.3 亚硝酸盐对人体健康的利弊 | 第17-19页 |
| 1.3.1 亚硝酸盐对人体健康的危害 | 第17-18页 |
| 1.3.2 亚硝酸盐的潜在益处 | 第18-19页 |
| 1.4 控制食品中亚硝酸盐的含量 | 第19-22页 |
| 1.4.1 物理方法 | 第20-21页 |
| 1.4.2 化学方法 | 第21页 |
| 1.4.3 生物方法 | 第21-22页 |
| 1.5 亚硝酸盐还原酶 | 第22-28页 |
| 1.5.1 亚硝酸盐还原酶的分类 | 第22-27页 |
| 1.5.1.1 铜型亚硝酸盐还原酶 | 第23-24页 |
| 1.5.1.2 细胞色素cd_1型亚硝酸盐还原酶 | 第24-25页 |
| 1.5.1.3 多聚血红素c型亚硝酸盐还原酶 | 第25-26页 |
| 1.5.1.4 依赖于铁氧还原蛋白的亚硝酸盐还原酶 | 第26-27页 |
| 1.5.2 亚硝酸盐还原酶的活性测定 | 第27页 |
| 1.5.3 亚硝酸盐还原酶的分离纯化方法 | 第27-28页 |
| 1.6 本论文的研究意义和研究内容 | 第28-30页 |
| 1.6.1 研究意义 | 第28页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第28-30页 |
| 第二章 蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和异源表达 | 第30-60页 |
| 2.1 引言 | 第30-31页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第31-34页 |
| 2.2.1 实验菌株 | 第31页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第31页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第31页 |
| 2.2.4 培养基和溶液 | 第31-34页 |
| 2.2.4.1 培养基 | 第32页 |
| 2.2.4.2 溶液 | 第32-34页 |
| 2.2.4.3 SDS-丙烯酰胺凝胶电泳制胶方法 | 第34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-44页 |
| 2.3.1 B.cereusLJ01中NiR编码基因的扩增 | 第34-35页 |
| 2.3.2 B.cereusLJ01中NiR编码基因的纯化回收及其测序 | 第35-36页 |
| 2.3.3 B.cereusLJ01中NiR的生物信息学分析 | 第36页 |
| 2.3.4 重组质粒pET-28a(+)-nir和pET-32a(+)-nir的构建 | 第36-41页 |
| 2.3.4.1 NiR编码基因的PCR产物和质粒的酶切及其切胶回收 | 第36-38页 |
| 2.3.4.2 NiR编码基因的PCR产物和质粒的连接、转化 | 第38页 |
| 2.3.4.3 扩增菌株E.coliTop10感受态细胞的制备与转化 | 第38-39页 |
| 2.3.4.4 克隆鉴定 | 第39-41页 |
| 2.3.5 重组子pET-28a(+)-nir-BL21(DE3)和pET-32a(+)-nir-BL21(DE3)的构建.. | 第41页 |
| 2.3.6 重组子中NiR的试表达 | 第41-44页 |
| 2.3.6.1 NiR的诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.3.6.2 NiR的镍柱亲和层析纯化 | 第42-43页 |
| 2.3.6.3 各洗脱组分的SDS-丙烯酰胺凝胶电泳测定 | 第43-44页 |
| 2.3.7 NiR编码基因对宿主细胞生长的影响 | 第44页 |
| 2.4 结果与分析 | 第44-59页 |
| 2.4.1 NiR的编码基因扩增与测序结果 | 第44-48页 |
| 2.4.2 NiR的生物信息学分析结果 | 第48-53页 |
| 2.4.2.1 NiR蛋白二级结构预测分析 | 第48-50页 |
| 2.4.2.2 NiR蛋白跨膜螺旋分析和信号肽分析 | 第50页 |
| 2.4.2.3 NiR蛋白的疏水性分析 | 第50-51页 |
| 2.4.2.4 NiR蛋白的三级结构预测分析 | 第51-53页 |
| 2.4.3 重组子菌落PCR鉴定 | 第53页 |
| 2.4.4 NiR在不同质粒和不同温度下的表达结果分析 | 第53-57页 |
| 2.4.5 NiR的编码基因对宿主细胞生长的影响结果分析 | 第57-59页 |
| 2.5 本章小结 | 第59-60页 |
| 第三章 基因工程菌产酶培养基成分及发酵条件的优化 | 第60-78页 |
| 3.1 引言 | 第60页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第60-61页 |
| 3.2.1 主要试剂 | 第60-61页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第61页 |
| 3.2.3 常用溶液及培养基 | 第61页 |
| 3.2.3.1 培养基 | 第61页 |
| 3.2.3.2 常用溶液 | 第61页 |
| 3.3 研究方法 | 第61-64页 |
| 3.3.1 培养基成分的优化 | 第61-63页 |
| 3.3.1.1 碳源 | 第61-62页 |
| 3.3.1.2 氮源 | 第62页 |
| 3.3.1.3 无机盐 | 第62-63页 |
| 3.3.2 Plackett-Burman试验和响应面法优化培养基成分 | 第63页 |
| 3.3.3 诱导条件的优化 | 第63-64页 |
| 3.3.3.1 诱导剂IPTG浓度的优化 | 第63页 |
| 3.3.3.2 诱导温度的优化 | 第63页 |
| 3.3.3.3 诱导时间的优化 | 第63-64页 |
| 3.3.4 响应面法优化诱导条件 | 第64页 |
| 3.4 结果与分析 | 第64-77页 |
| 3.4.1 培养基成分的单因素优化 | 第64-66页 |
| 3.4.1.1 碳源对重组菌生长的影响 | 第64-65页 |
| 3.4.1.2 氮源对重组菌生长的影响 | 第65-66页 |
| 3.4.1.3 无机盐对重组菌生长的影响 | 第66页 |
| 3.4.2 Plackett-Burman试验结果 | 第66-67页 |
| 3.4.3 生物量的Box-Behnken实验设计及响应面分析 | 第67-69页 |
| 3.4.4 生物量的响应面因子交互作用结果分析 | 第69-71页 |
| 3.4.5 诱导条件的单因素优化 | 第71-73页 |
| 3.4.5.1 诱导剂IPTG浓度对重组NiR可溶性表达的影响 | 第71-72页 |
| 3.4.5.2 诱导温度对重组NiR可溶性表达的影响 | 第72页 |
| 3.4.5.3 诱导时间对重组NiR可溶性表达的影响 | 第72-73页 |
| 3.4.6 产酶量的Box-Behnken实验设计及响应面分析 | 第73-75页 |
| 3.4.7 产酶量的响应面因子交互作用结果分析 | 第75-77页 |
| 3.5 本章小结 | 第77-78页 |
| 第四章 基因工程菌中NiR的纯化和酶学性质研究 | 第78-98页 |
| 4.1 引言 | 第78页 |
| 4.2 材料与仪器 | 第78-80页 |
| 4.2.1 主要试剂 | 第78-79页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第79页 |
| 4.2.3 培养基和常用溶液 | 第79-80页 |
| 4.2.3.1 培养基 | 第79页 |
| 4.2.3.2 常用溶液 | 第79-80页 |
| 4.2.4 NiR的测定 | 第80页 |
| 4.2.4.1 NiR的含量测定 | 第80页 |
| 4.2.4.2 NiR的酶活力单位定义 | 第80页 |
| 4.2.4.3 NiR的比活力计算公式 | 第80页 |
| 4.3 实验方法 | 第80-85页 |
| 4.3.1 重组NiR的诱导表达 | 第80-81页 |
| 4.3.2 重组NiR的镍柱亲和层析 | 第81页 |
| 4.3.3 重组NiR的酶学理化性质检测 | 第81-83页 |
| 4.3.3.1 重组NiR最适反应温度的测定 | 第81-82页 |
| 4.3.3.2 重组NiR最适反应pH值的测定 | 第82页 |
| 4.3.3.3 金属离子对重组NiR反应的影响 | 第82页 |
| 4.3.3.4 米氏常数K_m值的测定 | 第82-83页 |
| 4.3.4 重组NiR的脱盐和离子交换层析分离 | 第83-84页 |
| 4.3.5 重组NiR的凝胶过滤层析分离 | 第84页 |
| 4.3.6 重组NiR的结晶条件筛选 | 第84-85页 |
| 4.3.7 重组NiR的凝胶渗透色谱检测 | 第85页 |
| 4.4 结果与分析 | 第85-97页 |
| 4.4.1 重组NiR的镍柱亲和层析纯化结果分析 | 第85-87页 |
| 4.4.2 重组NiR的酶学性质研究结果分析 | 第87-91页 |
| 4.4.2.1 重组NiR的最适反应温度 | 第87-88页 |
| 4.4.2.2 重组NiR的最适反应pH | 第88-89页 |
| 4.4.2.3 金属离子对重组NiR的影响 | 第89-91页 |
| 4.4.2.4 米氏常数K_m值的测定 | 第91页 |
| 4.4.3 重组NiR的进一步纯化结果 | 第91-95页 |
| 4.4.3.1 重组NiR的脱盐 | 第92-93页 |
| 4.4.3.2 重组NiR的阴离子交换层析 | 第93-94页 |
| 4.4.3.3 重组NiR的凝胶排阻层析纯化 | 第94-95页 |
| 4.4.4 重组NiR的GPC检测结果 | 第95-96页 |
| 4.4.5 重组NiR结晶条件筛选的结果 | 第96-97页 |
| 4.5 本章小结 | 第97-98页 |
| 结论与展望 | 第98-101页 |
| 一、结论 | 第98-99页 |
| 二、创新之处 | 第99-100页 |
| 三、展望 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-120页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第120-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 附件 | 第123页 |
