Anabaena sp.PCC 7120脂肪氧合酶分子改造的研究
| 摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-39页 |
| 1 脂肪氧合酶概述 | 第19-23页 |
| ·脂肪氧合酶的来源 | 第19页 |
| ·脂肪氧合酶的催化性质 | 第19-20页 |
| ·脂肪氧合酶的作用机制 | 第20-21页 |
| ·脂肪氧合酶的活力测定 | 第21-22页 |
| ·影响脂肪氧合酶活力测定的因素 | 第21页 |
| ·脂肪氧合酶活力测定方法 | 第21-22页 |
| ·脂肪氧合酶的应用现状 | 第22-23页 |
| 2 蛋白质的热稳定性改造 | 第23-24页 |
| ·蛋白质的热稳定性 | 第23页 |
| ·蛋白质的热力学稳定性 | 第23页 |
| ·蛋白质的动力学稳定性 | 第23页 |
| ·蛋白质的热稳定性影响因素 | 第23-24页 |
| ·静电作用 | 第23页 |
| ·氢键 | 第23-24页 |
| ·硫键 | 第24页 |
| ·疏水作用 | 第24页 |
| ·α-螺旋 | 第24页 |
| ·折叠熵 | 第24页 |
| 3 蛋白质的分子改造技术 | 第24-31页 |
| ·非理性设计 | 第25-29页 |
| ·定向进化技术 | 第25-28页 |
| ·高通量筛选方法 | 第28-29页 |
| ·理性设计 | 第29-30页 |
| ·PCR介导的定点突变 | 第29-30页 |
| ·活性位点组合饱和测试 | 第30页 |
| ·结构导向法 | 第30页 |
| ·半理性设计 | 第30页 |
| ·脂肪氧合酶分子改造研究进展 | 第30-31页 |
| 4 本研究的目的意义及内容 | 第31-33页 |
| 参考文献 | 第33-39页 |
| 第二章 脂肪氧合酶高通量筛选体系的建立 | 第39-57页 |
| 1 材料和方法 | 第39-43页 |
| ·材料 | 第39-41页 |
| ·菌种 | 第39页 |
| ·试剂 | 第39-40页 |
| ·主要仪器和设备 | 第40页 |
| ·培养基和相关试剂的配制 | 第40-41页 |
| ·方法 | 第41-43页 |
| ·菌种活化 | 第41页 |
| ·摇瓶发酵 | 第41页 |
| ·细胞破碎 | 第41-42页 |
| ·脂肪氧合酶活力测定 | 第42页 |
| ·脂肪氧合酶高通量筛选模型的建立 | 第42-43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-52页 |
| ·细胞破碎条件单因素试验 | 第43-46页 |
| ·溶菌酶质量浓度的确定 | 第43页 |
| ·溶菌酶处理时间的确定 | 第43-44页 |
| ·EDTA-2Na添加量的确定 | 第44-45页 |
| ·表面活性剂及其体积分数的确定 | 第45页 |
| ·冻融温度的确定 | 第45-46页 |
| ·冻融次数的确定 | 第46页 |
| ·细胞破碎条件正交试验 | 第46-48页 |
| ·酶活性测定方法比较 | 第48-50页 |
| ·脂肪氧合酶高通量筛选模型的建立 | 第50-52页 |
| ·装液量对96孔板中菌体量的影响 | 第50页 |
| ·装液量对96孔板中脂肪氧合酶活力的影响 | 第50-51页 |
| ·96孔板中脂肪氧合酶钝化温度的选择 | 第51-52页 |
| ·高通量筛选方法的统计学分析 | 第52页 |
| 3 讨论 | 第52-53页 |
| 4 本章小结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-57页 |
| 第三章 脂肪氧合酶分子的定向进化研究 | 第57-95页 |
| 1 材料和方法 | 第57-68页 |
| ·材料 | 第57-59页 |
| ·菌种和质粒 | 第57-58页 |
| ·工具酶和试剂 | 第58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58-59页 |
| ·培养基与相关溶液 | 第59页 |
| ·方法 | 第59-68页 |
| ·脂肪氧合酶重组质粒的提取 | 第59-60页 |
| ·易错PCR反应体系的条件优化 | 第60-61页 |
| ·易错PCR扩增脂肪氧合酶基因 | 第61页 |
| ·DNA改组(DNA Shuffling) | 第61-63页 |
| ·突变库的构建 | 第63-65页 |
| ·目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第65页 |
| ·突变库的筛选 | 第65页 |
| ·突变酶的纯化 | 第65-66页 |
| ·脂肪氧合酶的活力测定 | 第66页 |
| ·突变酶的SDS-PAGE分析 | 第66页 |
| ·突变酶的酶学性质分析 | 第66-67页 |
| ·突变体的DNA测序及氨基酸序列分析 | 第67页 |
| ·突变酶的三维结构同源模拟及突变位点分析 | 第67页 |
| ·突变酶的圆二色谱分析 | 第67页 |
| ·突变酶的热变性分析 | 第67-68页 |
| 2 结果与分析 | 第68-89页 |
| ·易错PCR条件优化 | 第68-73页 |
| ·Mn~(2+)梯度 | 第68页 |
| ·Mg~(2+)梯度 | 第68-69页 |
| ·dNTPs梯度 | 第69-70页 |
| ·TaqDNA聚合酶 | 第70页 |
| ·易错PCR条件的正交试验 | 第70-72页 |
| ·易错PCR构建突变库 | 第72页 |
| ·易错PCR突变库的筛选 | 第72-73页 |
| ·DNA Shuffling技术 | 第73-76页 |
| ·亲本基因的获得 | 第73页 |
| ·DNaseⅠ酶量的确定 | 第73-74页 |
| ·DNaseⅠ酶切时间的确定 | 第74页 |
| ·无引物PCR | 第74-75页 |
| ·有引物PCR | 第75页 |
| ·DNA Shuffling突变库的筛选 | 第75-76页 |
| ·突变酶的纯化 | 第76页 |
| ·突变酶的SDS-PAGE分析 | 第76-77页 |
| ·突变酶的催化动力学 | 第77-78页 |
| ·突变酶的酶学性质 | 第78-82页 |
| ·突变酶的热稳定性 | 第78-79页 |
| ·突变酶的最适反应温度 | 第79-80页 |
| ·突变酶的最适pH | 第80-81页 |
| ·金属离子对突变酶活性的影响 | 第81-82页 |
| ·突变体的序列分析 | 第82-83页 |
| ·突变酶的三维结构同源模拟及突变位点分析 | 第83-85页 |
| ·突变酶的圆二色谱分析 | 第85-86页 |
| ·突变酶的热变性分析 | 第86-89页 |
| 3 讨论 | 第89-90页 |
| 4 本章小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-95页 |
| 第四章 脂肪氧合酶分子的定点突变研究 | 第95-119页 |
| 1 材料和方法 | 第95-100页 |
| ·材料 | 第95-96页 |
| ·菌种和质粒 | 第95页 |
| ·工具酶和试剂 | 第95页 |
| ·主要仪器和设备 | 第95-96页 |
| ·培养基与相关溶液 | 第96页 |
| ·方法 | 第96-100页 |
| ·定点突变位点的选择 | 第96页 |
| ·定点突变引物的设计 | 第96-98页 |
| ·重叠延伸PCR法定点突变 | 第98页 |
| ·PCR产物的纯化及其与pMD19-T载体的连接 | 第98-99页 |
| ·大肠杆菌感受态制备和连接产物的转化 | 第99页 |
| ·目的基因与表达载体pET-32a连接 | 第99页 |
| ·目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第99页 |
| ·脂肪氧合酶活力的测定 | 第99页 |
| ·突变酶的酶学性质分析 | 第99页 |
| ·突变酶的三维结构模拟及突变位点分析 | 第99页 |
| ·突变酶对面团的动态流变学作用影响 | 第99-100页 |
| 2 结果与分析 | 第100-114页 |
| ·突变酶基因的获得 | 第100-102页 |
| ·305位饱和定点突变酶基因的获得 | 第100页 |
| ·组合定点突变酶基因的获得 | 第100-102页 |
| ·反应产物转化、涂板、克隆鉴定 | 第102页 |
| ·突变基因的序列分析 | 第102页 |
| ·突变酶活力的测定 | 第102-105页 |
| ·饱和定点的突变体活力 | 第102-104页 |
| ·组合定点突变体酶活力 | 第104-105页 |
| ·突变酶的酶学性质分析 | 第105-110页 |
| ·突变酶的热稳定性 | 第105-107页 |
| ·突变酶的最适反应温度 | 第107-108页 |
| ·突变酶的最适pH | 第108-109页 |
| ·不同金属离子对突变酶活性的影响 | 第109-110页 |
| ·突变酶的三维结构模拟及突变位点分析 | 第110-112页 |
| ·突变酶对面团的动态流变学作用影响 | 第112-114页 |
| 3 讨论 | 第114-115页 |
| 4 本章小结 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-119页 |
| 全文结论 | 第119-121页 |
| 创新摘要 | 第121-123页 |
| 硕士期间发表文章 | 第123-125页 |
| 附录 | 第125-127页 |
| 致谢 | 第127页 |
