| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 1 引言 | 第10-16页 |
| ·L-苯丙氨酸（L-Phe）发酵法生产与菌种的选育 | 第10-11页 |
| ·L-Phe 的发酵法生产 | 第10-11页 |
| ·L-Phe 生产菌株的选育 | 第11页 |
| ·代谢工程与苯丙氨酸的生产 | 第11-16页 |
| ·代谢工程概述 | 第11-12页 |
| ·芳香族氨基酸的生物合成途径及其调控 | 第12-14页 |
| ·L-苯丙氨酸（L-Phe）生物合成的策略与优化 | 第14-16页 |
| ·优化整体代谢途径 | 第16页 |
| 2 实验材料 | 第16-18页 |
| ·质粒、菌株和引物 | 第16-17页 |
| ·工具酶和生化试剂 | 第17-18页 |
| ·培养基和溶液 | 第18页 |
| ·仪器 | 第18页 |
| 3 实验方法 | 第18-32页 |
| ·大肠杆菌苯丙氨酸生物合成途径关键酶基因pheA、aroF和ppsA分别克隆与表达 | 第18-23页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第19-20页 |
| ·质粒的提取 | 第20页 |
| ·PCR 产物与载体酶切和连接反应 | 第20-21页 |
| ·质粒的转化 | 第21-22页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第22页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第22-23页 |
| ·两个酶基因pheA，aroF的串联表达重组子的构建及发酵产苯丙氨酸培养条件的研究 | 第23-28页 |
| ·串联重组子pZE12-pheA-aroF的构建 | 第24-25页 |
| ·串联重组子pZE12-RBS-pheA-aroF的构建 | 第25-27页 |
| ·工程菌的发酵 | 第27页 |
| ·调整 pH 值及检测细菌的生长状况 | 第27-28页 |
| ·薄板层析法粗略测定L-Phe 浓度 | 第28页 |
| ·三个酶基因pheA，aroF，ppsA的串联表达重组子的构建 | 第28-32页 |
| ·串联重组子pZE12-AFP的构建 | 第29-30页 |
| ·调整串联重组子pZE12-AFP 中酶基因ppsA的RBS | 第30-32页 |
| ·工程菌的发酵 | 第32页 |
| ·氨基酸分析仪精确测定苯丙氨酸浓度 | 第32页 |
| 4 实验结果与分析 | 第32-45页 |
| ·大肠杆菌苯丙氨酸生物合成途径关键酶基因pheA、aroF 和ppsA 分别克隆与表达 | 第32-36页 |
| ·PCR 扩增pheA、aroF 和ppsA基因 | 第32-33页 |
| ·重组质粒pZE12-pheA，pZE12-aroF，pZE12-ppsA的构建及鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组子pTrc-99a-pheA，pTrc-99a-aroF，pTrc-99a-ppsA 的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| ·重组质粒的热诱导表达 | 第35-36页 |
| ·实验分析 | 第36页 |
| ·两个酶基因pheA，aroF的串联表达重组子的构建及发酵产苯丙氨酸培养条件的研究 | 第36-40页 |
| ·pheA-aroF fusion PCR 结果 | 第36-37页 |
| ·片段AF 与载体的酶切反应结果 | 第37-38页 |
| ·PCR法快速鉴定重组子pZE12-AF，pZE12-RBS-AF | 第38页 |
| ·重组子pZE12-AF和pZE12-RBS-AF SDS-PAGE 分析 | 第38-39页 |
| ·工程菌产苯丙氨酸的估算 | 第39-40页 |
| ·实验分析 | 第40页 |
| ·三个酶基因pheA，aroF，ppsA的串联表达重组子的构建 | 第40-44页 |
| ·重组质粒pZE12-AFP 和pZE12-RBS-AFP鉴定结果 | 第40-42页 |
| ·重组子pZE12-AFP和pZE12-RBS-AFP SDS-PAGE分析 | 第42页 |
| ·工程菌的构建及产苯丙氨酸的估算 | 第42-43页 |
| ·氨基酸分析仪测定苯丙氨酸含量结果 | 第43-44页 |
| ·实验分析 | 第44页 |
| ·重组基因协同表达对比 | 第44-45页 |
| 5 讨论 | 第45-46页 |
| 6 结论 | 第46-47页 |
| ·本文结论 | 第46页 |
| ·不足及今后还应进行的工作 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-52页 |
| 附录 1 培养基和溶液的配制 | 第52-53页 |
| 附录 2 部分实验操作方法 | 第53-54页 |
| 作者简介 | 第54页 |
