| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-39页 |
| 1.1 酿酒酵母表面展示技术 | 第16-25页 |
| 1.1.1 酿酒酵母细胞壁的组成 | 第16-17页 |
| 1.1.2 酵母细胞壁蛋白的连接方式 | 第17-18页 |
| 1.1.3 酵母GPI锚定蛋白 | 第18-20页 |
| 1.1.4 酿酒酵母表面展示技术简介 | 第20-22页 |
| 1.1.5 酿酒酵母展示技术的应用 | 第22-25页 |
| 1.2 β-葡萄糖苷酶 | 第25-34页 |
| 1.2.1 β-葡萄糖苷酶来源以及特性 | 第25-26页 |
| 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的分类级作用机制 | 第26-27页 |
| 1.2.3 β-葡萄糖苷酶酶活检测方法以及重组表达 | 第27-28页 |
| 1.2.4 β-葡萄糖苷酶在葡萄酒中的应用 | 第28-34页 |
| 1.3 酿酒酵母中异源蛋白的表达 | 第34-37页 |
| 1.3.1 酿酒酵母表达载体分类以及元件 | 第34页 |
| 1.3.2 酿酒酵母表达载体构建方法以及特点 | 第34-35页 |
| 1.3.3 酿酒酵母分泌表达异源蛋白的影响因素 | 第35-37页 |
| 1.4 研究目的和内容 | 第37-39页 |
| 第二章 酿酒酵母表面展示平台的搭建 | 第39-50页 |
| 2.1 仪器设备与材料 | 第40-42页 |
| 2.1.1 仪器设备 | 第40页 |
| 2.1.2 .菌株、质粒及引物 | 第40-42页 |
| 2.1.3 缓冲液和培养基配方 | 第42页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第42页 |
| 2.2 实验方法 | 第42-44页 |
| 2.2.1 基础分子操作 | 第42-43页 |
| 2.2.2 酵母基因组提取 | 第43页 |
| 2.2.3 目标基因克隆 | 第43页 |
| 2.2.4 绿色荧光蛋白表面展示2μ高拷贝载体的构建路线 | 第43-44页 |
| 2.2.5 酿酒酵母BY4741 电转化感受态的制备及转化 | 第44页 |
| 2.2.6 激光共聚焦显微镜观察 | 第44页 |
| 2.3 结果与分析 | 第44-48页 |
| 2.3.1 锚定蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的扩增 | 第44-45页 |
| 2.3.2 绿色荧光蛋白锚定2μ高拷贝载体的构建 | 第45-47页 |
| 2.3.3 不同类型的绿色荧光蛋白阳性重组菌的获得 | 第47页 |
| 2.3.4 利用激光共聚焦显微镜确定表面展示系统的建立 | 第47-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-49页 |
| 2.5 小结 | 第49-50页 |
| 第三章 表面展示β-葡萄糖苷酶高拷贝质粒的构建 | 第50-61页 |
| 3.1 仪器设备与材料 | 第51-52页 |
| 3.1.1 仪器设备 | 第51页 |
| 3.1.2 菌株、质粒及引物 | 第51-52页 |
| 3.1.3 缓冲液和培养基配方 | 第52页 |
| 3.1.4 主要试剂 | 第52页 |
| 3.2 实验方法 | 第52-55页 |
| 3.2.1 pYES2/CT/α-Factor质粒GAL1 启动子的替换 | 第52-53页 |
| 3.2.2 β-葡萄糖苷酶的信号肽预测 | 第53页 |
| 3.2.3 β-葡萄糖苷酶表面展示2μ载体的构建 | 第53-54页 |
| 3.2.4 β-葡萄糖苷酶的酶活测定 | 第54-55页 |
| 3.3 结果与分析 | 第55-59页 |
| 3.3.1 pYES2-GPD和 pYES2-SED2μ载体的构建 | 第55-56页 |
| 3.3.2 β-葡萄糖苷酶基因的克隆 | 第56-57页 |
| 3.3.3 表面展示β-葡萄糖苷酶2μ载体的构建 | 第57-58页 |
| 3.3.4 酿酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶工程菌株的构建及酶活测定 | 第58-59页 |
| 3.4 讨论 | 第59页 |
| 3.5 小结 | 第59-61页 |
| 第四章 表面展示β-葡萄糖苷酶整合型载体的构建 | 第61-78页 |
| 4.1 仪器设备与材料 | 第62-64页 |
| 4.1.1 仪器设备 | 第62页 |
| 4.1.2 菌株、质粒以及引物 | 第62-64页 |
| 4.1.3 缓冲液和培养基配方 | 第64页 |
| 4.1.4 主要试剂 | 第64页 |
| 4.2 实验方法 | 第64-67页 |
| 4.2.1 新型整合型质粒构建 | 第64-65页 |
| 4.2.2 Cre质粒构建 | 第65-66页 |
| 4.2.3 新型载体的使用以及循环利用测试 | 第66页 |
| 4.2.4 整合型β-葡萄糖苷酶表面展示载体的构建 | 第66-67页 |
| 4.2.5 整合型表面展示β-葡萄糖苷酶酶活测定 | 第67页 |
| 4.2.6 β-葡萄糖苷酶实时定量PCR检测 | 第67页 |
| 4.3 结果与分析 | 第67-76页 |
| 4.3.1 新型整合型载体的构建 | 第67-70页 |
| 4.3.2 pSH63-Leu2 质粒的构建 | 第70-71页 |
| 4.3.3 新型整合型质粒Yip-loxp-URA3 的循环利用测试 | 第71-72页 |
| 4.3.4 整合型β-葡萄糖苷酶表面展示工程菌的构建以及酶活测定 | 第72-75页 |
| 4.3.5 β-葡萄糖苷酶基因实时定量PCR检测 | 第75-76页 |
| 4.4 讨论 | 第76-77页 |
| 4.5 小结 | 第77-78页 |
| 第五章 转录融合伴侣TFPs的筛选 | 第78-89页 |
| 5.1 仪器设备与材料 | 第79-83页 |
| 5.1.1 仪器设备 | 第79页 |
| 5.1.2 菌株、质粒及引物 | 第79-83页 |
| 5.1.3 缓冲液和培养基配方 | 第83页 |
| 5.1.4 主要试剂 | 第83页 |
| 5.2 实验方法 | 第83-85页 |
| 5.2.1 构建不同TFPs表面展示β-葡萄糖苷酶的载体 | 第83-85页 |
| 5.2.2 不同TFPs表面展示β-葡萄糖苷酶酶活测定 | 第85页 |
| 5.3 结果与分析 | 第85-87页 |
| 5.3.1 TFPs的克隆 | 第85-86页 |
| 5.3.2 不同TFPs表面展示β-葡萄糖苷酶的工程菌构建 | 第86页 |
| 5.3.3 不同TFPs表面展示β-葡萄糖苷酶酶活测定 | 第86-87页 |
| 5.4 讨论 | 第87-88页 |
| 5.5 小结 | 第88-89页 |
| 第六章 表面展示β-葡萄糖苷酶的酶学特性以及对香气糖苷水解能力的探索 | 第89-99页 |
| 6.1 实验设备与材料 | 第90-92页 |
| 6.1.1 仪器设备 | 第90页 |
| 6.1.2 菌株、质粒、葡萄原料及引物 | 第90-91页 |
| 6.1.3 缓冲液和培养基配方 | 第91页 |
| 6.1.4 主要试剂 | 第91-92页 |
| 6.2 实验方法 | 第92-93页 |
| 6.2.1 分泌型β-葡萄糖苷酶整合型载体的构建 | 第92页 |
| 6.2.2 表面展示β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究 | 第92页 |
| 6.2.3 理化指标测定 | 第92-93页 |
| 6.2.4 香气糖苷的提取 | 第93页 |
| 6.2.5 模拟汁发酵 | 第93页 |
| 6.2.6 萜类香气测定 | 第93页 |
| 6.2.7 数据处理 | 第93页 |
| 6.3 结果与分析 | 第93-97页 |
| 6.3.1 分泌型β-葡萄糖苷酶工程菌的构建 | 第93-94页 |
| 6.3.2 表面展示β-葡萄糖苷酶的酶学特性 | 第94-95页 |
| 6.3.3 在葡萄模拟汁发酵过程中工程菌BY-GSE酶活测定 | 第95-96页 |
| 6.3.4 在模拟汁发酵过程中工程菌BY-GSE对香气糖苷的水解能力 | 第96-97页 |
| 6.4 讨论 | 第97-98页 |
| 6.5 小结 | 第98-99页 |
| 第七章 结论、创新点与展望 | 第99-100页 |
| 7.1 结论 | 第99页 |
| 7.2 创新点 | 第99页 |
| 7.3 展望 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-118页 |
| 致谢 | 第118-120页 |
| 作者简介 | 第120页 |
