| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-29页 |
| 1.1 大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917)研究简述 | 第11-15页 |
| 1.1.1 益生EcN 1917的发现及分类学特征 | 第11-12页 |
| 1.1.2 EcN 1917的益生机制 | 第12-13页 |
| 1.1.3 EcN 1917的应用 | 第13-14页 |
| 1.1.4 EcN 1917在肠道中的定殖 | 第14-15页 |
| 1.2 大肠杆菌的毒素-抗毒素系统 | 第15-20页 |
| 1.2.1 大肠杆菌毒素-抗毒素系统的分类功能 | 第15-16页 |
| 1.2.2 大肠杆菌毒素-抗毒素系统影响生物膜形成 | 第16-19页 |
| 1.2.3 大肠杆菌TA系统影响持留形成 | 第19-20页 |
| 1.3 关于mazEF和hipAB的研究 | 第20-24页 |
| 1.3.1 mazEF基因结构与功能 | 第20-22页 |
| 1.3.2 hipA基因结构与功能 | 第22-24页 |
| 1.4 CRISPRi技术 | 第24-26页 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas技术的研究 | 第24页 |
| 1.4.2 CRISPRi(CRISPR/dCas9)技术 | 第24-26页 |
| 1.5 本文主要研究问题、技术路线及意义 | 第26-29页 |
| 1.5.1 问题的提出及研究价值 | 第26-27页 |
| 1.5.2 选择技术路线 | 第27-29页 |
| 第二章 大肠杆菌Nissle 1917 mazEF基因结构与活性研究 | 第29-53页 |
| 2.1 引言 | 第29页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第29-37页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第29-32页 |
| 2.2.1.1 菌种与培养基 | 第29页 |
| 2.2.1.2 药品与耗材 | 第29-30页 |
| 2.2.1.3 仪器与设备 | 第30-31页 |
| 2.2.1.4 引物与质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第32-37页 |
| 2.2.2.1 EcN 1917的活化培养 | 第32页 |
| 2.2.2.2 EcN 1917中TA系统预测 | 第32页 |
| 2.2.2.3 Escherichia coli Nissle 1917中mazEF基因生物信息学分析 | 第32页 |
| 2.2.2.4 mazEF基因克隆 | 第32-33页 |
| 2.2.2.5 mazEF基因与质粒的双酶切 | 第33页 |
| 2.2.2.6 mazE基因和质粒pETDuet-1的双酶切 | 第33-34页 |
| 2.2.2.7 mazEF基因与质粒的连接 | 第34-35页 |
| 2.2.2.8. mazE基因片段以及重组质粒pEmT的双酶切 | 第35页 |
| 2.2.2.9 重组质粒pEmTA的构建 | 第35-36页 |
| 2.2.2.10 pEmT、pEmA、pEmTA质粒的转化验证 | 第36页 |
| (1) 感受态细胞的制作:使用(Competent cell Preparation Kit,takara)试剂盒根据它的使用方法制作大肠杆菌DH5α以及BL21的感受态细胞。 | 第36页 |
| (2) 质粒的转化 | 第36页 |
| 2.2.2.11 重组质粒的验证 | 第36页 |
| 2.2.2.12 重组质粒的表达 | 第36-37页 |
| 2.2.2.13 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA生长曲线测定 | 第37页 |
| 2.2.2.14 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA平板点样 | 第37页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第37-52页 |
| 2.3.1 EcN 1917中TA系统分布 | 第37-41页 |
| 2.3.2 mazEF基因序列比对以及结构分析 | 第41-45页 |
| 2.3.3 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA构建及筛选 | 第45-50页 |
| 2.3.4 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA在E.coli BL21中表达 | 第50-52页 |
| 2.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 第三章 E.coli Nissle 1917 mazEF与hipA基因原位敲低 | 第53-69页 |
| 3.1 引言 | 第53页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第53-60页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第53-55页 |
| 3.2.1.1 出发质粒 | 第53-54页 |
| 3.2.1.2 试剂与器材 | 第54页 |
| 3.2.1.3 引物与菌株 | 第54-55页 |
| 3.2.2 实验方法 | 第55-60页 |
| 3.2.2.1 技术路线 | 第55-57页 |
| 3.2.2.2 sgRNA序列设计 | 第57页 |
| 3.2.2.3 sgRNA质粒构建 | 第57-58页 |
| 3.2.2.4 质粒转化 | 第58-59页 |
| 3.2.2.5 重组质粒在E.coli Nissle 1917中诱导表达 | 第59页 |
| 3.2.2.6 提取总RNA | 第59-60页 |
| 3.2.2.7 RT-PCR | 第60页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第60-68页 |
| 3.3.1 sgRNA-mazE,sgRNA-hipA序列设计克隆与构建 | 第60-61页 |
| 3.3.2 ppgRmA与ppgRmh质粒构建与筛选 | 第61-66页 |
| 3.3.3 RT-PCR检测mazEF和hipA原位敲低 | 第66-68页 |
| 3.4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 原位敲低mazEF和hipA基因探索其对持留以及生物膜的影响 | 第69-81页 |
| 4.1 引言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第69-71页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第69-70页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第70-71页 |
| 4.2.2.1 生物膜形成测定 | 第70页 |
| 4.2.2.2 持留细胞生长测定 | 第70-71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-79页 |
| 4.3.1 mazEF与hipA沉默表达后菌株生长情况 | 第71-72页 |
| 4.3.2 mazEF与hipA沉默表达后对生物膜生长的影响 | 第72-76页 |
| 4.3.3 mazEF与hipA原位敲低后对持留菌形成的影响 | 第76-79页 |
| 4.3.3.1 酶法探究mazEF与hipA原位敲低后对持留细胞形成的影响 | 第76页 |
| 4.3.3.2 抗生素法探究mazEF原位敲低后对持留菌形成的影响 | 第76-79页 |
| 4.4 本章小结 | 第79-81页 |
| 结论与展望 | 第81-83页 |
| 结论 | 第81页 |
| 展望 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-92页 |
| 附录一 pEmT基因测序 | 第92-93页 |
| 附录二 pEmA测序 | 第93-94页 |
| 附录三 pEmTA测序 | 第94-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
