| 目录 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 缩略语表 | 第15-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-34页 |
| 1 乳酸菌与食品级载体 | 第17页 |
| 2 乳酸菌食品级载体选择标记 | 第17-22页 |
| ·显性选择标记 | 第17-20页 |
| ·Nis~r选择标记 | 第18页 |
| ·LafI选择标记 | 第18-19页 |
| ·代谢糖类选择标记 | 第19页 |
| ·噬菌体抗性选择标记 | 第19-20页 |
| ·其他显性选择标记 | 第20页 |
| ·互补选择标记 | 第20-21页 |
| ·alr互补选择标记 | 第20-21页 |
| ·lacF互补选择标记 | 第21页 |
| ·supD食品级互补选择标记系统 | 第21页 |
| ·两组分食品级选择标记 | 第21-22页 |
| 3 食品级高效诱导表达系统—NICE系统 | 第22-28页 |
| ·nisin生物合成基因与NICE系统的提出 | 第22-23页 |
| ·NICE系统的构建及原理 | 第23-26页 |
| ·NICE系统的特点 | 第26-27页 |
| ·NICE系统的应用前景 | 第27-28页 |
| 4 乳酸菌蛋白质分泌表达研究进展 | 第28-34页 |
| ·分泌表达载体的发展 | 第28-31页 |
| ·分泌表达可避免蛋白分解作用 | 第31-32页 |
| ·分泌表达的蛋白质的稳定性 | 第32-33页 |
| ·展望 | 第33-34页 |
| 第二章 乳酸菌两组分食品级选择标记复制子缺失质粒的构建 | 第34-53页 |
| 1 引言 | 第34页 |
| 2 料和方法 | 第34-46页 |
| ·材料 | 第34-37页 |
| ·菌株、质粒 | 第34-35页 |
| ·主要生化试剂 | 第35页 |
| ·引物： | 第35-36页 |
| ·实验设备 | 第36页 |
| ·培养基,抗生素以及常用溶液的配制 | 第36-37页 |
| ·方法 | 第37-46页 |
| ·菌株培养 | 第37-38页 |
| ·质粒提取 | 第38-39页 |
| ·紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度 | 第39-40页 |
| ·琼脂糖电泳鉴定DNA | 第40页 |
| ·PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化 | 第40-41页 |
| ·回收酶切后的大片段 | 第41-42页 |
| ·PCR扩增rep基因 | 第42页 |
| ·限制性酶切： | 第42-43页 |
| ·构建克隆载体： | 第43页 |
| ·连接产物的电转化和筛选 | 第43-45页 |
| ·转化子的复制子缺刻 | 第45-46页 |
| 3 结果与讨论 | 第46-52页 |
| ·L.lactis SMQ719／pRAF800质粒提取及rep扩增 | 第46-47页 |
| ·pMG36e的提取及酶切回收Em~r | 第47-48页 |
| ·rep和Em~r的连接转化 | 第48页 |
| ·克隆子的筛选 | 第48-50页 |
| ·pEm~r：rep质粒的PCR检测和酶切鉴定 | 第50-51页 |
| ·pEm~r：Arep质粒的构建 | 第51-52页 |
| ·pEm~r：rep的酶切、削平及连接 | 第51页 |
| ·pEm~r：△rep质粒的检测 | 第51-52页 |
| 4 小结 | 第52-53页 |
| 第三章 乳酸菌两组分食品级诱导表达系统载体的构建 | 第53-72页 |
| 1 引言 | 第53页 |
| 2 材料和方法 | 第53-62页 |
| ·材料 | 第53-55页 |
| ·菌株、质粒 | 第53页 |
| ·主要生化试剂 | 第53-54页 |
| ·引物 | 第54-55页 |
| ·实验设备 | 第55页 |
| ·常规培养基及溶液的配制 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-62页 |
| ·菌株培养 | 第55-56页 |
| ·高纯度质粒中量提取方法 | 第56页 |
| ·紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度 | 第56页 |
| ·琼脂糖电泳鉴定DNA | 第56页 |
| ·PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化 | 第56页 |
| ·回收酶切后的大片段 | 第56页 |
| ·P_(nisA)-MCS-T_(pepN)片段的PCR扩增 | 第56-57页 |
| ·限制性酶切 | 第57-58页 |
| ·目的基因与载体的连接用T4连接酶连接 | 第58-59页 |
| ·乳酸菌的电穿孔转化和筛选 | 第59-60页 |
| ·重组载体pRNA48的鉴定 | 第60-62页 |
| 3 结果与讨论 | 第62-71页 |
| ·L. lactis NZ9000／pNZ8048与L. lactis SMQ719／pRAF800的质粒提取 | 第62-63页 |
| ·P_(nisA)-MSC-T_(pepN)的PCR | 第63-65页 |
| ·P_(nisA)-MSC-T_(pepN)基因的克隆及克隆子的筛选 | 第65-66页 |
| ·pRNA48的鉴定 | 第66-71页 |
| ·质粒大小比较法鉴定重组质粒 | 第66-67页 |
| ·pRNA48的PCR鉴定 | 第67页 |
| ·pRNA48的限制酶酶切鉴定内切酶图谱鉴定 | 第67-68页 |
| ·克隆入pRNA48的目的基因的测序 | 第68-71页 |
| 4 小结 | 第71-72页 |
| 第四章 乳酸菌两组分食品级诱导表达系统分泌表达载体的构建 | 第72-92页 |
| 1 前言 | 第72页 |
| 2 材料和方法 | 第72-84页 |
| ·材料 | 第72-74页 |
| ·菌株、质粒 | 第72-73页 |
| ·主要生化试剂 | 第73页 |
| ·引物 | 第73页 |
| ·实验设备 | 第73页 |
| ·常规培养基及溶液的配制 | 第73-74页 |
| ·方法 | 第74-84页 |
| ·菌株培养 | 第75页 |
| ·高纯度质粒中量提取方法 | 第75页 |
| ·紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度 | 第75页 |
| ·琼脂糖电泳鉴定 | 第75页 |
| ·PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化 | 第75页 |
| ·回收酶切后的大片段 | 第75页 |
| ·SP_(Usp45)-nucA-cwa_(M6)-t1t2片段的PCR扩增 | 第75页 |
| ·限制性酶切 | 第75-77页 |
| ·目的基因与载体的连接用T4连接酶连接 | 第77页 |
| ·乳酸菌的电穿孔转化和筛选 | 第77页 |
| ·重组载体pRNV48的鉴定 | 第77-78页 |
| ·克隆入pRNV48的SP_(Usp45)-nucA-cwa_(M6)-t1t2的T／A克隆和测序 | 第78-80页 |
| ·Nuc的诱导表达 | 第80-83页 |
| ·Nuc活性检测方法 | 第83-84页 |
| 3 结果与讨论 | 第84-91页 |
| ·pRNV48的构建 | 第84-89页 |
| ·L. lactis MG1363／pVE5524和L. lactis NZ9000／pRNA48的质粒提取 | 第84-85页 |
| ·SP_(Usp45)-nucA-cwa_(M6)-t1t2片段的PCR | 第85-86页 |
| ·基因的连接、转化及克隆子的筛选 | 第86页 |
| ·pPNV48的鉴定 | 第86-89页 |
| ·Nuc在L. lactis NZ9000中高效诱导分泌表达的初步研究 | 第89-91页 |
| 4 小结 | 第91-92页 |
| 第五章 细胞内表达载体pRNA48-OprF／H的构建及细胞内表达初步研究 | 第92-108页 |
| 1 前言 | 第92页 |
| 2 材料和方法 | 第92-97页 |
| ·材料 | 第92-93页 |
| ·菌株、质粒 | 第92-93页 |
| ·主要生化试剂 | 第93页 |
| ·引物 | 第93页 |
| ·实验设备 | 第93页 |
| ·常规培养基及溶液的配制 | 第93页 |
| ·方法 | 第93-97页 |
| ·菌株培养 | 第93-94页 |
| ·高纯度质粒中量提取方法 | 第94页 |
| ·紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度 | 第94页 |
| ·琼脂糖电泳鉴定DNA | 第94页 |
| ·PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化 | 第94页 |
| ·回收酶切后的大片段 | 第94页 |
| ·OprF／H的PCR扩增 | 第94页 |
| ·限制性酶切 | 第94-95页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第95页 |
| ·乳酸菌的电穿孔转化和筛选 | 第95页 |
| ·重组载体pRNA48-OprF／H的鉴定 | 第95-97页 |
| ·克隆入pRNA48的目的基因(OprF／H)的T／A克隆和测序 | 第97页 |
| ·OprF／H的诱导表达 | 第97页 |
| 3 结果与讨论 | 第97-106页 |
| ·pRNA48-OprF／H的构建 | 第98-103页 |
| ·L. lactis NZ9000／pRNA48和E. coli BL21／pGEX-OprF／H的质粒提取 | 第98页 |
| ·OprF／H片段的PCR | 第98-99页 |
| ·OprF／H基因的克隆及克隆子的筛选 | 第99-100页 |
| ·pRNA-OprF／H48的鉴定 | 第100-101页 |
| ·克隆入pRNA48的目的基因(OprF／H)的测序 | 第101-103页 |
| ·OprF／H在L. lactis NZ9000中高效诱导表达的初步研究 | 第103-106页 |
| 4 小结 | 第106-108页 |
| 第六章 分泌表达载体pRNV48-OprF／H的构建、锚定表达以及表达蛋白的活性检测 | 第108-134页 |
| 1 前言 | 第108页 |
| 2 材料和方法 | 第108-116页 |
| ·材料 | 第108-110页 |
| ·菌株、质粒和实验动物 | 第108-109页 |
| ·主要生化试剂 | 第109页 |
| ·引物 | 第109页 |
| ·实验设备 | 第109-110页 |
| ·常规培养基及溶液的配制 | 第110页 |
| ·方法 | 第110-116页 |
| ·菌株培养： | 第110页 |
| ·高纯度质粒中量提取方法 | 第110页 |
| ·紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度 | 第110页 |
| ·琼脂糖电泳鉴定 | 第110页 |
| ·PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化 | 第110页 |
| ·回收酶切后的大片段 | 第110页 |
| ·OprF／H片段的PCR扩增 | 第110-111页 |
| ·限制性酶切 | 第111-112页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第112页 |
| ·乳酸菌的电穿孔转化和筛选 | 第112页 |
| ·重组载体pRNV48的鉴定 | 第112-113页 |
| ·克隆入pRNV48的目的基因(OprF／H)的T／A克隆和测序 | 第113-114页 |
| ·OprF／H的诱导表达 | 第114页 |
| ·目的蛋白的免疫原性和免疫保护性研究方法 | 第114-116页 |
| 3 结果与讨论 | 第116-133页 |
| ·pRNV48-OprF／H的构建 | 第116-122页 |
| ·L. lactis NZ9000／pRNV48和E coli BL21／pGEX-OprF／H的质粒提取 | 第116-117页 |
| ·OprF／H片段的PCR | 第117-118页 |
| ·OprF／H片段基因的克隆及克隆子的筛选 | 第118页 |
| ·pRNV-OprF／H48的鉴定 | 第118-120页 |
| ·目的基因的测序 | 第120-122页 |
| ·OprF／H在L. lactis NZ9000中高效诱导细胞壁锚定表达的初步研究 | 第122-124页 |
| ·目的蛋白OprF／H的免疫原性的初步研究 | 第124-133页 |
| ·直接凝集反应 | 第125-128页 |
| ·抗体血清滴度的测定 | 第128-130页 |
| ·Western-blot初步分析OprF／H的抗原性 | 第130-133页 |
| 4 小结 | 第133-134页 |
| 第七章 主要研究结果和建议 | 第134-137页 |
| 1 研究结果 | 第134-136页 |
| 2 建议 | 第136-137页 |
| 参考文献： | 第137-148页 |
| 附录1：P_(nisA)-MCS-T_(pepN)(pRNA48)测序序列 | 第148-149页 |
| 附录2：P_(nisA)-MCS-T_(pepN)(pRNB48)测序序列 | 第149-150页 |
| 附录3：SP_(Usp45)-nucA-cwa_(M6)-t1t2(pRNV48)测序序列 | 第150-152页 |
| 附录4：oprF／H(pRNA48-oprF／H)测序序列 | 第152-154页 |
| 附录5：oprF／H(pRNV48-oprF／H)测序序列 | 第154-156页 |
| 附录6：P_(nisA)-MCS-T_(pepN)(pRNA48)测序图谱 | 第156-157页 |
| 附录7：P_(nisA)-MCS-T_(pepN)(pRNB48)测序图谱 | 第157-158页 |
| 附录8：SP_(Usp45)-nucA-cwa_(M6)-t1t2(pRNV48)测序图谱 | 第158-160页 |
| 附录9：oprF／H(pRNA48-oprF／H)测序图谱 | 第160-164页 |
| 附录10：oprF／H(pRNV48-oprF／H)测序图谱 | 第164-167页 |
