| 摘要 | 第1-17页 |
| Abstract | 第17-22页 |
| 第一章 文献综述 | 第22-37页 |
| 1 前言 | 第22页 |
| 2 骨骼开发的研究现状 | 第22-31页 |
| ·骨骼的化学成分 | 第22-24页 |
| ·骨骼的开发利用现状 | 第24-26页 |
| ·骨胶原多肽的国内外研究进展 | 第26-31页 |
| ·骨胶原多肽的生物学意义 | 第26-27页 |
| ·骨胶原多肽的生理功能 | 第27-29页 |
| ·骨胶原多肽制备的研究进展 | 第29-30页 |
| ·胶原多肽分子量的测定及其分离方法 | 第30-31页 |
| 3 钙的生理特点与多肽螯合盐的特点 | 第31-33页 |
| ·钙的生理学功能 | 第31页 |
| ·补钙产品的现状 | 第31-32页 |
| ·多肽螯合盐的特点及研究进展 | 第32-33页 |
| 4 本课题的研究意义、研究内容及技术路线 | 第33-37页 |
| ·研究意义 | 第33-34页 |
| ·研究内容 | 第34-36页 |
| ·技术路线 | 第36-37页 |
| 第二章 牛骨降解菌的筛选、鉴定及诱变 | 第37-62页 |
| 1 材料与方法 | 第38-46页 |
| ·材料 | 第38-40页 |
| ·原料 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38-39页 |
| ·主要仪器设备 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·方法 | 第40-46页 |
| ·胶原蛋白酶产生菌的筛选 | 第40-41页 |
| ·菌种鉴定 | 第41-42页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第42-43页 |
| ·定向诱变方法 | 第43-45页 |
| ·测定方法 | 第45-46页 |
| ·数据分析 | 第46页 |
| 2 结果与分析 | 第46-58页 |
| ·菌种初筛的实验结果 | 第46-48页 |
| ·牛骨素降解的筛选实验与产物SDS-PAGE分析 | 第48-49页 |
| ·发酵牛骨粉的筛选实验结果 | 第49-50页 |
| ·MBL13菌株的细胞形态特征 | 第50-51页 |
| ·MBL13菌株的菌落特征 | 第51页 |
| ·MBL13菌株的生理生化特征 | 第51-53页 |
| ·16SrDNA的PCR扩增电泳结果 | 第53页 |
| ·16SrDNA序列与发育树分析 | 第53-54页 |
| ·MBL13菌株的细胞结构检测 | 第54-55页 |
| ·NTG诱变MBL13菌株处理时间的确定 | 第55-56页 |
| ·紫外线诱变MBL13菌株时间的确定 | 第56-57页 |
| ·NTG和紫外线复合诱变MBL13菌株的实验结果 | 第57-58页 |
| ·诱变菌株的遗传稳定性 | 第58页 |
| 3 讨论 | 第58-60页 |
| ·胶原蛋白酶的定义和测定方法 | 第58-59页 |
| ·牛骨降解菌的筛选模式的构建 | 第59-60页 |
| ·诱变技术的筛选 | 第60页 |
| ·筛选诱变菌株的安全性评价 | 第60页 |
| 4 结论 | 第60-62页 |
| 第三章 B. cereus MBL13-U菌株发酵产酶条件的优化 | 第62-79页 |
| 1 材料与方法 | 第62-66页 |
| ·材料 | 第62-63页 |
| ·菌种 | 第62页 |
| ·主要试剂 | 第62-63页 |
| ·主要仪器 | 第63页 |
| ·培养基 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-66页 |
| ·培养方法 | 第63页 |
| ·培养基优化实验 | 第63-64页 |
| ·发酵条件的优化实验 | 第64-65页 |
| ·测定方法 | 第65页 |
| ·数据分析 | 第65-66页 |
| 2 结果与分析 | 第66-78页 |
| ·菌种的生长曲线 | 第66页 |
| ·碳源对菌株产酶的影响 | 第66-67页 |
| ·氮源对菌株产酶的影响 | 第67-68页 |
| ·金属离子对菌株产酶的影响 | 第68页 |
| ·正交实验优化发酵培养基组成 | 第68-70页 |
| ·接种量对菌株产酶的影响 | 第70-71页 |
| ·发酵温度对菌株产酶的影响 | 第71页 |
| ·培养基初始pH对菌株产酶的影响 | 第71-72页 |
| ·发酵时间对菌株产酶的影响 | 第72-73页 |
| ·瓶装量对菌株产酶的影响 | 第73页 |
| ·二次回归正交旋转设计优化产酶的发酵工艺条件 | 第73-78页 |
| ·二次回归模型的建立与检验 | 第75-76页 |
| ·响应面和等高线分析 | 第76-77页 |
| ·最佳作用参数的确定和模型验证实验 | 第77-78页 |
| 3 结论 | 第78-79页 |
| 第四章 胶原蛋白酶(BCC)的分离纯化及其特性研究 | 第79-97页 |
| 1 材料与方法 | 第79-84页 |
| ·材料 | 第79-80页 |
| ·菌种 | 第79页 |
| ·主要试剂 | 第79-80页 |
| ·主要仪器 | 第80页 |
| ·培养基 | 第80页 |
| ·方法 | 第80-84页 |
| ·产酶发酵培养方法 | 第80-81页 |
| ·菌种的生长曲线与酶活曲线的测定 | 第81页 |
| ·BCC酶的分离纯化 | 第81-82页 |
| ·BCC的酶学性质研究 | 第82-83页 |
| ·BCC酶与其他酶的对比试验 | 第83页 |
| ·测定方法 | 第83-84页 |
| ·数据分析 | 第84页 |
| 2 结果与分析 | 第84-94页 |
| ·B. cereus MBL13-U菌株的生长曲线与酶活曲线 | 第84-85页 |
| ·BCC酶的分离纯化 | 第85-87页 |
| ·硫酸铵梯度盐析 | 第85页 |
| ·DEAE-cellulose 52柱层析 | 第85-86页 |
| ·Sephadex G-100凝胶柱层析 | 第86页 |
| ·BCC酶的纯化结果 | 第86-87页 |
| ·BCC酶的氨基酸组成 | 第87-88页 |
| ·BCC反应最适温度和热稳定性 | 第88-89页 |
| ·BCC酶最适反应pH和pH稳定性 | 第89页 |
| ·不同金属离子对BCC酶活的影响 | 第89-90页 |
| ·抑制剂对BCC酶活的影响 | 第90-91页 |
| ·BCC的底物特异性 | 第91-92页 |
| ·BCC与标准Ⅰ型胶原酶水解骨明胶对比实验 | 第92-93页 |
| ·BCC与蛋白酶水解牛骨粉的对比实验 | 第93-94页 |
| 3 讨论 | 第94-96页 |
| ·BCC酶与其他来源的微生物胶原蛋白酶的比较 | 第94-95页 |
| ·BCC酶的应用前景 | 第95-96页 |
| 4 结论 | 第96-97页 |
| 第五章 BCC酶解牛骨胶原蛋白的动力学研究 | 第97-115页 |
| 1 材料与方法 | 第97-102页 |
| ·材料 | 第97-98页 |
| ·原料 | 第97页 |
| ·主要试剂 | 第97-98页 |
| ·主要仪器与设备 | 第98页 |
| ·方法 | 第98-102页 |
| ·牛骨胶原蛋白的提取工艺 | 第98-99页 |
| ·牛骨胶原蛋白的结构表征 | 第99-100页 |
| ·牛骨胶原蛋白的酶解方法 | 第100页 |
| ·牛骨胶原蛋白的酶解动力学研究 | 第100页 |
| ·BCC酶解牛骨胶原蛋白的动态过程 | 第100页 |
| ·测定方法 | 第100-102页 |
| ·数据分析 | 第102页 |
| 2 结果与分析 | 第102-113页 |
| ·提取牛骨胶原蛋白骨料脱脂工艺的确定 | 第102-103页 |
| ·提取牛骨胶原蛋白骨料脱钙工艺的确定 | 第103-105页 |
| ·盐酸浓度对骨钙溶出速度的影响 | 第104页 |
| ·粒径对骨钙溶出速度的影响 | 第104-105页 |
| ·提取牛骨胶原蛋白的提取介质选择 | 第105页 |
| ·制备的牛骨胶原蛋白 | 第105页 |
| ·牛骨胶原蛋白的紫外光谱分析 | 第105-106页 |
| ·牛骨胶原蛋白的傅立叶红外分析 | 第106-107页 |
| ·牛骨胶原蛋白的热收缩温度分析 | 第107页 |
| ·牛骨胶原蛋白的电泳和电镜扫描分析 | 第107-108页 |
| ·底物浓度对酶解反应的影响 | 第108页 |
| ·温度对酶解反应的影响 | 第108-109页 |
| ·酶浓度对酶解反应的影响 | 第109-110页 |
| ·pH对酶解反应的影响 | 第110页 |
| ·时间对酶解反应的影响 | 第110-111页 |
| ·BCC酶解牛骨胶原蛋白的动力学特性 | 第111-112页 |
| ·BCC酶解牛骨胶原蛋白的动态变化 | 第112-113页 |
| 3 讨论 | 第113-114页 |
| 4 结论 | 第114-115页 |
| 第六章 B. cereus MBL13-U发酵牛骨粉制备胶原多肽(BBCP) | 第115-134页 |
| 1 材料与方法 | 第115-120页 |
| ·材料 | 第115-116页 |
| ·原料、菌种与培养基 | 第115-116页 |
| ·主要试剂 | 第116页 |
| ·主要仪器和设备 | 第116页 |
| ·方法 | 第116-120页 |
| ·发酵菌株种子液的制备 | 第116页 |
| ·发酵牛骨粉制备BBCP的工艺流程 | 第116页 |
| ·牛骨粉预处理方法 | 第116-117页 |
| ·发酵工艺条件的优化 | 第117-118页 |
| ·测定方法 | 第118-119页 |
| ·数据分析 | 第119-120页 |
| 2 结果与分析 | 第120-132页 |
| ·原料的处理 | 第120页 |
| ·牛骨粉溶液发酵前后游离氨基酸含量的变化 | 第120-121页 |
| ·SEM观察发酵骨粉颗粒的微观结构变化 | 第121-122页 |
| ·牛骨粉与牛骨素的发酵对比实验 | 第122-123页 |
| ·牛骨素显微结构与成分分析 | 第123-124页 |
| ·接种量对B. cereus MBL13-U发酵的影响 | 第124-125页 |
| ·起始pH值对B. cereus MBL13-U发酵的影响 | 第125页 |
| ·牛骨素添加量对B. cereus MBL13-U发酵的影响 | 第125-126页 |
| ·发酵温度对B. cereus MBL13-U发酵的影响 | 第126-127页 |
| ·发酵时间对B. cereus MBL13-U发酵的影响 | 第127页 |
| ·二次回归正交旋转设计优化发酵工艺条件 | 第127-132页 |
| ·二次回归模型的建立与检验 | 第129页 |
| ·方差分析和显著性检验 | 第129-130页 |
| ·响应面和等高线分析 | 第130-131页 |
| ·利用回归方程确定最佳作用参数和模型验证实验 | 第131-132页 |
| 3 讨论 | 第132页 |
| 4 结论 | 第132-134页 |
| 第七章 混合菌种发酵牛骨粉制备胶原多肽(BBCP) | 第134-155页 |
| 1 材料与方法 | 第135-138页 |
| ·材料 | 第135-136页 |
| ·菌种及试剂 | 第135页 |
| ·培养基及培养条件 | 第135-136页 |
| ·主要仪器和设备 | 第136页 |
| ·方法 | 第136-138页 |
| ·菌种的拮抗作用 | 第136页 |
| ·混合菌种发酵牛骨粉制备BBCP的条件优化 | 第136-137页 |
| ·混合菌种发酵牛骨粉动力学模型的构建 | 第137-138页 |
| ·测定方法 | 第138页 |
| ·数据分析 | 第138页 |
| 2 结果与分析 | 第138-153页 |
| ·菌种间的拮抗作用实验结果 | 第138-139页 |
| ·菌种配比对胶原多肽含量的影响 | 第139页 |
| ·糖的添加量对胶原多肽含量的影响 | 第139-140页 |
| ·骨素添加量对胶原多肽含量的影响 | 第140-141页 |
| ·正交实验优化菌种配比和培养基组成 | 第141-142页 |
| ·二次回归正交旋转设计优化发酵工艺条件 | 第142-148页 |
| ·二次回归模型的建立与检验 | 第144页 |
| ·方差分析和显著性检验 | 第144-145页 |
| ·响应面和等高线分析 | 第145-146页 |
| ·最佳发酵参数的确定和模型验证 | 第146-148页 |
| ·发酵过程中代谢变化特征 | 第148页 |
| ·菌体生长动力学模型 | 第148-150页 |
| ·BBCP生成的动力学模型 | 第150-151页 |
| ·底物消耗动力学模型 | 第151-153页 |
| 3 讨论 | 第153页 |
| 4 结论 | 第153-155页 |
| 第八章 牛骨胶原多肽(BBCP)组分分析和超滤膜分离 | 第155-169页 |
| 1 材料与方法 | 第156-159页 |
| ·材料 | 第156页 |
| ·原料与试剂 | 第156页 |
| ·仪器与设备 | 第156页 |
| ·方法 | 第156-159页 |
| ·BBCP发酵液的预处理 | 第156页 |
| ·BBCP的组分分析 | 第156-157页 |
| ·BBCP的超滤膜分离参数确定 | 第157-158页 |
| ·超滤膜的截留液和通过液的SDS-PAGE分析 | 第158页 |
| ·Sephadex G-25凝胶层析测定超滤成分的分子量分布 | 第158页 |
| ·测定方法 | 第158-159页 |
| ·数据分析 | 第159页 |
| 2 结果与分析 | 第159-167页 |
| ·BBCP的氨基酸成分分析 | 第159页 |
| ·BBCP的紫外(UV)光谱分析 | 第159-160页 |
| ·BBCP超滤膜分离膜参数的确定 | 第160-163页 |
| ·操作压力对膜透过速率的影响 | 第160-161页 |
| ·胶原多肽液温度对膜透过速率的影响 | 第161-162页 |
| ·不同胶原多肽液pH值对膜透过速率的影响 | 第162页 |
| ·操作时间对膜透过速率的影响 | 第162-163页 |
| ·BBCP超滤膜分离的结果分析 | 第163-164页 |
| ·BBCP的超滤段的SDS-PAGE分析 | 第164-165页 |
| ·BBCP的各超滤段的分子量分布 | 第165-167页 |
| ·标准物质洗脱体积的测定 | 第165页 |
| ·BBCP发酵液及各超滤段的分子量分布分析 | 第165-167页 |
| 3 讨论 | 第167-168页 |
| 4 结论 | 第168-169页 |
| 第九章 牛骨胶原多肽螯合钙(BBCP-Ca)制备研究 | 第169-185页 |
| 1 材料与方法 | 第170-173页 |
| ·材料 | 第170页 |
| ·原料与主要试剂 | 第170页 |
| ·主要仪器 | 第170页 |
| ·方法 | 第170-173页 |
| ·混合菌种发酵牛骨素制备胶原多肽 | 第170页 |
| ·骨钙的制备 | 第170-171页 |
| ·钙溶液的配制 | 第171页 |
| ·BBCP溶液的配制 | 第171页 |
| ·胶原多肽螯合钙制备的工艺流程 | 第171页 |
| ·螯合制备条件的确定 | 第171页 |
| ·BBCP-Ca制备工艺条件的优化实验 | 第171-172页 |
| ·测定方法 | 第172-173页 |
| 2 结果与分析 | 第173-183页 |
| ·钙源的确定 | 第173-174页 |
| ·有机沉淀剂的选择 | 第174页 |
| ·BBCP分子量的确定 | 第174-175页 |
| ·pH值的确定 | 第175-176页 |
| ·BBCP与骨钙的质量比的确定 | 第176-178页 |
| ·BBCP浓度的确定 | 第178-179页 |
| ·BBCP-Ca制备工艺条件的正交优化实验结果 | 第179-180页 |
| ·反应温度和时间的确定 | 第180-182页 |
| ·有机沉淀剂与水的体积比确定 | 第182页 |
| ·验证实验 | 第182-183页 |
| 3 讨论 | 第183-184页 |
| ·骨钙的存在形式 | 第183-184页 |
| ·螯合指标的确定 | 第184页 |
| 4 结论 | 第184-185页 |
| 第十章 BBCP-Ca的理化性质与结构研究 | 第185-211页 |
| 1 材料与方法 | 第185-190页 |
| ·材料 | 第185-186页 |
| ·原辅材料与试剂 | 第185-186页 |
| ·主要仪器设备 | 第186页 |
| ·方法 | 第186-190页 |
| ·BBCP-Ca的定性检测 | 第186-187页 |
| ·BBCP-Ca的成分组成 | 第187页 |
| ·BBCP-Ca的溶解度测定 | 第187页 |
| ·BBCP-Ca的持钙能力测定 | 第187页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE电泳和质谱联用分析BBCP-Ca的分子量 | 第187-188页 |
| ·SEM观察螯合前后BBCP与BBCP-Ca的微观聚集状态的变化 | 第188页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的紫外(UV)光谱分析 | 第188页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的荧光光谱分析 | 第188页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的红外光谱(IR)分析 | 第188-189页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的拉曼光谱(Raman)测定 | 第189页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的圆二色光谱(CD)的测定 | 第189页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的X-衍射能谱仪(EDS)的测定 | 第189页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的X-衍射(XRD)晶体特性的测定 | 第189页 |
| ·螯合前后BBCP与BBCP-Ca的核磁共振氢谱(HNMR)分析 | 第189页 |
| ·BBCP-Ca的HPLC分析 | 第189-190页 |
| 2 结果与分析 | 第190-208页 |
| ·BBCP-Ca的定性检测 | 第190页 |
| ·BBCP-Ca的组成成分测定 | 第190-191页 |
| ·BBCP-Ca的溶解度测定 | 第191-192页 |
| ·BBCP-Ca在不同温度水中的溶解度 | 第191页 |
| ·BBCP-Ca在不同pH值水中的溶解度 | 第191-192页 |
| ·BBCP-Ca在有机溶剂中的溶解度 | 第192页 |
| ·胃肠道模拟检测BBCP-Ca持钙能力 | 第192-193页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE和质谱联用分析BBCP-Ca的分子量 | 第193-194页 |
| ·SEM观察螯合前后BBCP和BBCP-Ca的微观聚集态变化 | 第194-195页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的UV光谱分析 | 第195-196页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的荧光光谱分析 | 第196-197页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的IR分析 | 第197-200页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的Raman分析 | 第200-201页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的CD分析 | 第201-203页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的EDS分析 | 第203-204页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的XRD分析 | 第204-205页 |
| ·螯合前后BBCP和BBCP-Ca的HNMR分析 | 第205-207页 |
| ·BBCP-Ca的HPLC分析 | 第207-208页 |
| 3 讨论 | 第208-209页 |
| ·BBCP-Ca的结构测定方法 | 第208页 |
| ·BBCP-Ca的吸收机制 | 第208-209页 |
| 4 结论 | 第209-211页 |
| 全文结论 | 第211-214页 |
| 创新点 | 第214-215页 |
| 延续研究计划 | 第215-216页 |
| 展望 | 第216-217页 |
| 参考文献 | 第217-240页 |
| 致谢 | 第240-241页 |
| 附录 | 第241-243页 |
| 作者简介 | 第243-244页 |
