| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 第一章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.1 生鲜食品中的腐败菌 | 第14-15页 |
| 1.1.1 食品腐败菌类型 | 第14页 |
| 1.1.2 荧光假单胞菌 | 第14-15页 |
| 1.2 革兰氏阴性菌与群体感应 | 第15-22页 |
| 1.2.1 群体感应 | 第15页 |
| 1.2.2 自诱导物、合成酶、受体及特异性 | 第15-19页 |
| 1.2.2.1 自诱导物 | 第15-16页 |
| 1.2.2.2 AHLs合成酶 | 第16-18页 |
| 1.2.2.3 受体及特异性 | 第18-19页 |
| 1.2.3 群体感应与食品腐败 | 第19-20页 |
| 1.2.4 群体感应与细菌生物被膜形成 | 第20-21页 |
| 1.2.5 群体感应与细菌抗胁迫性 | 第21-22页 |
| 1.3 假单胞菌中的群体感应 | 第22-24页 |
| 1.3.1 铜绿假单胞菌中的群体感应 | 第22-23页 |
| 1.3.2 荧光假单胞菌中的群体感应 | 第23-24页 |
| 1.3.3 其他假单胞菌中的群体感应 | 第24页 |
| 1.4 本课题的研究目的、意义和内容 | 第24-26页 |
| 第二章 荧光假单胞菌PF07基因组中LuxI/LuxR生物信息学分析 | 第26-45页 |
| 2.1 前言 | 第26页 |
| 2.2 材料与设备 | 第26-27页 |
| 2.2.1 菌株及培养条件 | 第26页 |
| 2.2.2 试剂 | 第26-27页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第27页 |
| 2.3 试验方法 | 第27-31页 |
| 2.3.1 报告菌法和LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性 | 第27-28页 |
| 2.3.1.1 PF07生长曲线测定 | 第27页 |
| 2.3.1.2 报告菌法检测PF07信号分子活性 | 第27-28页 |
| 2.3.1.3 PF07信号分子提取 | 第28页 |
| 2.3.1.4 LC/MS-MS检测PF07信号分子 | 第28页 |
| 2.3.2 菌体的培养与收集 | 第28-29页 |
| 2.3.3 总DNA的提取及全基因组测序 | 第29页 |
| 2.3.4 文库构建与质检 | 第29页 |
| 2.3.5 P.fluorescens PF07基因组组分分析 | 第29页 |
| 2.3.6 P.fluorescens PF07基因功能注释 | 第29-30页 |
| 2.3.7 P.fluorescens PF07 Lux/LuxR基因PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.3.7.1 DNA提取 | 第30页 |
| 2.3.7.2 引物设计及PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.3.8 LuxI/LuxR同源性、保守位点分析及三维结构模拟 | 第31页 |
| 2.4 数据处理和分析 | 第31-32页 |
| 2.5 结果分析 | 第32-43页 |
| 2.5.1 报告菌法分析PF07信号分子活性 | 第32-33页 |
| 2.5.2 LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性 | 第33页 |
| 2.5.3 DNA文库构建与测序质量评估 | 第33-35页 |
| 2.5.3.1 测序数据概况 | 第33-34页 |
| 2.5.3.2 基因组大小预测 | 第34页 |
| 2.5.3.3 基因组组装分析 | 第34-35页 |
| 2.5.4 P.fluorescens PF07基因组组分分析 | 第35-38页 |
| 2.5.4.1 编码基因预测 | 第35-36页 |
| 2.5.4.2 ncRNA预测 | 第36页 |
| 2.5.4.3 Prophage预测 | 第36-37页 |
| 2.5.4.4 CRISPRs预测 | 第37-38页 |
| 2.5.5 P.fluorescens PF07基因功能分析 | 第38-39页 |
| 2.5.5.1 P.fluorescens PF07蛋白质COG聚类分析 | 第38页 |
| 2.5.5.2 P.fluorescens PF07次级代谢基因簇分析 | 第38-39页 |
| 2.5.6 PCR验证P.fluorescens PF07中LuxI与LuxR基因 | 第39-40页 |
| 2.5.7 LuxI/LuxR进化树、保守位点分析及三维结构模拟 | 第40-43页 |
| 2.6 讨论 | 第43-45页 |
| 第三章 LuxI/LuxR缺失对PF07生物被膜、致腐及抗胁迫力的影响 | 第45-67页 |
| 3.1 前言 | 第45页 |
| 3.2 材料与设备 | 第45-46页 |
| 3.2.1 材料、菌株及培养条件 | 第45-46页 |
| 3.2.2 试剂 | 第46页 |
| 3.2.3 主要仪器设备 | 第46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-52页 |
| 3.3.1 LuxI及LuxR缺失株的构建 | 第46-48页 |
| 3.3.2 LuxI及LuxR缺失株基因缺失验证 | 第48页 |
| 3.3.2.1 DNA提取 | 第48页 |
| 3.3.2.2 引物设计及PCR扩增 | 第48页 |
| 3.3.3 报告菌法及LC-MS/MS检测AHLs活性 | 第48页 |
| 3.3.4 野生株和缺失株的生长能力比较 | 第48页 |
| 3.3.5 野生株和缺失株的生物被膜形成能力测定 | 第48-50页 |
| 3.3.5.1 结晶紫法测定生物被膜量 | 第48-49页 |
| 3.3.5.2 粘附能力测定 | 第49页 |
| 3.3.5.3 水溶性胞外多糖含量检测 | 第49页 |
| 3.3.5.4 CLSM及SEM观察粘附被膜 | 第49-50页 |
| 3.3.5.5 泳动能力测定 | 第50页 |
| 3.3.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力测定 | 第50-52页 |
| 3.3.6.1 灭菌鱼汁制备和接种 | 第50-51页 |
| 3.3.6.2 鱼汁中生长曲线测定 | 第51页 |
| 3.3.6.3 胞外蛋白酶活性测定 | 第51页 |
| 3.3.6.4 嗜铁素相对含量测定 | 第51-52页 |
| 3.3.6.5 TVB-N含量测定 | 第52页 |
| 3.3.7 野生株和缺失株抗胁迫力的测定 | 第52页 |
| 3.4 数据处理和分析 | 第52页 |
| 3.5 结果分析 | 第52-64页 |
| 3.5.1 △luxR和△luxI基因缺失验证 | 第52-53页 |
| 3.5.2 生物报告菌法和LC-MS/MS检测野生株和缺失株AHLs活性 | 第53-55页 |
| 3.5.3 野生株和缺失株的生长 | 第55页 |
| 3.5.4 野生株和缺失株生物被膜形成比较 | 第55-60页 |
| 3.5.4.1 生物被膜结晶紫定量比较 | 第55-56页 |
| 3.5.4.2 粘附能力 | 第56-57页 |
| 3.5.4.3 水溶性胞外多糖含量比较 | 第57-58页 |
| 3.5.4.4 CLSM及SEM观察被膜结构差异 | 第58-59页 |
| 3.5.4.5 泳动能力比较 | 第59-60页 |
| 3.5.5 野生株和缺失株抗胁迫力比较 | 第60-61页 |
| 3.5.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力比较 | 第61-64页 |
| 3.5.6.1 鱼汁中生长差异的比较 | 第61-62页 |
| 3.5.6.2 胞外蛋白酶活性分析 | 第62-63页 |
| 3.5.6.3 嗜铁素相对含量比较 | 第63页 |
| 3.5.6.4 TVB-N含量比较 | 第63-64页 |
| 3.6 讨论 | 第64-67页 |
| 第四章 基于转录组学分析LuxI/LuxR对PF07生理功能调控的机制 | 第67-91页 |
| 4.1 前言 | 第67页 |
| 4.2 材料与仪器 | 第67-68页 |
| 4.2.1 主要试剂和培养基 | 第67-68页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第68页 |
| 4.3 转录组学测序 | 第68-71页 |
| 4.3.1 细菌培养及样品制备 | 第68页 |
| 4.3.2 样品总RNA提取纯化及质量检测 | 第68页 |
| 4.3.3 文库构建与测序 | 第68-69页 |
| 4.3.4 质量控制与参考基因组比对分析 | 第69页 |
| 4.3.5 基因表达水平分析及差异基因筛选 | 第69-70页 |
| 4.3.6 差异基因筛选 | 第70页 |
| 4.3.7 差异表达基因的GO富集 | 第70-71页 |
| 4.3.8 差异表达基因的KEGG pathway富集 | 第71页 |
| 4.4 荧光定量PCR验证 | 第71-73页 |
| 4.4.1 样品总RNA提取 | 第71-72页 |
| 4.4.2 总RNA反转录 | 第72页 |
| 4.4.3 荧光定量PCR | 第72-73页 |
| 4.5 数据处理和分析 | 第73页 |
| 4.6 结果与分析 | 第73-87页 |
| 4.6.1 转录组reads质量与统计分析 | 第73-74页 |
| 4.6.2 差异基因表达分析 | 第74-76页 |
| 4.6.3 差异基因聚类分析 | 第76-77页 |
| 4.6.4 差异表达基因GO富集分析 | 第77页 |
| 4.6.5 差异表达基因GO富集分析KEGG Pathway富集分析结果 | 第77-79页 |
| 4.6.6 差异表达基因分类整理 | 第79-84页 |
| 4.6.6.1 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens生物被膜相关基因的影响 | 第81-82页 |
| 4.6.6.2 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens致腐性相关基因的影响 | 第82-83页 |
| 4.6.6.3 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens抗胁迫能力相关基因的影响 | 第83-84页 |
| 4.6.9 荧光定量PCR验证 | 第84-86页 |
| 4.6.9.1 PCR产物扩增曲线及引物特异性分析 | 第84页 |
| 4.6.9.2 基因表达量差异 | 第84-86页 |
| 4.6.10 群体感应LuxI/LuxR调控机制模拟图 | 第86-87页 |
| 4.7 讨论 | 第87-91页 |
| 第五章 总结、创新点和展望 | 第91-93页 |
| 5.1 总结 | 第91-92页 |
| 5.2 创新点 | 第92页 |
| 5.3 展望 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-102页 |
| 致谢 | 第102-103页 |
| 附录Ⅰ 转录组学差异基因列表 | 第103-111页 |
| 附录Ⅱ 攻读硕士学位期间主要研究成果 | 第111-112页 |
