| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 前言 | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 合成生物学及生物合成路径 | 第11-13页 |
| 1.1.1 合成生物学的发展及应用 | 第11-12页 |
| 1.1.2 生物合成路径的人工设计和实现 | 第12-13页 |
| 1.2 甾体激素类药物的生物合成路径及研究现状 | 第13-17页 |
| 1.2.1 甾体类药物的生物合成 | 第13-16页 |
| 1.2.2 7-脱氢胆固醇简介 | 第16页 |
| 1.2.3 7-脱氢胆固醇的生物合成路径 | 第16-17页 |
| 1.3 酵母细胞固醇类代谢路径概述 | 第17-19页 |
| 1.4 本课题研究内容及思路 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第21页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第21-22页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.4 培养基配制 | 第23-24页 |
| 2.2 基因元件 | 第24-26页 |
| 2.2.1 实验室酵母模块化表达质粒 | 第24-25页 |
| 2.2.2 7-DHC合成路径外源基因的合成 | 第25页 |
| 2.2.3 7-DHC合成路径内源基因的获得 | 第25-26页 |
| 2.2.4 其他相关外源基因的合成 | 第26页 |
| 2.3 DNA操作方法 | 第26-28页 |
| 2.3.1 目标产物的PCR扩增和回收 | 第26-27页 |
| 2.3.2 酶切与连接反应 | 第27页 |
| 2.3.3 连接产物或质粒转化大肠杆菌感受态细胞 | 第27页 |
| 2.3.4 DNA片段或质粒转化酵母细胞 | 第27-28页 |
| 2.3.5 阳性转化子筛选验证及测序 | 第28页 |
| 2.4 蛋白提取方法 | 第28-29页 |
| 2.4.1 总蛋白的提取 | 第28-29页 |
| 2.4.2 可溶性蛋白和包涵体蛋白的提取 | 第29页 |
| 2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） | 第29-31页 |
| 2.5.1 SDS-PAGE试剂的配制 | 第29-30页 |
| 2.5.2 聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳条件 | 第30-31页 |
| 2.6 无细胞Pure System反应体系 | 第31-32页 |
| 2.6.1 反应体系及过程 | 第31页 |
| 2.6.2 放射性同位素标记法直接放射自显影 | 第31-32页 |
| 第三章 7-DHC合成路径的构建及底盘细胞选择 | 第32-43页 |
| 3.1 DHCR24-t HMGR表达盒的构建 | 第32-34页 |
| 3.1.1 DHCR24外源基因单元模块的构建 | 第32-33页 |
| 3.1.2 上游内源基因t HMGR单元模块的构建 | 第33页 |
| 3.1.3 内外源单元模块的拼接 | 第33-34页 |
| 3.2 7-DHC人工合成细胞的发酵 | 第34-37页 |
| 3.2.1 不同单敲菌株底盘细胞与基因表达模块的结合设计 | 第34-35页 |
| 3.2.2 菌株发酵培养及产物提取 | 第35页 |
| 3.2.3 菌株生长曲线比较 | 第35-37页 |
| 3.3 产物定性定量分析 | 第37-42页 |
| 3.3.1 标准曲线的测定 | 第37-38页 |
| 3.3.2 产物的定性分析 | 第38-39页 |
| 3.3.3 产物的定量分析 | 第39-40页 |
| 3.3.4 其余固醇类产物的鉴定和比较 | 第40-42页 |
| 3.4 小结 | 第42-43页 |
| 第四章 7-DHC合成酵母的后鲨烯路径基因模块化探究 | 第43-54页 |
| 4.1 后鲨烯路径基因模块的构建 | 第43-45页 |
| 4.1.1 单基因模块质粒构建 | 第43-44页 |
| 4.1.2 基于酶作用位置和路径节点的模块化组合质粒构建 | 第44-45页 |
| 4.2 经后鲨烯路径优化的 7-DHC合成酵母菌株的发酵 | 第45-47页 |
| 4.2.1 7-DHC合成菌株与后鲨烯路径基因模块适配性设计 | 第45页 |
| 4.2.2 各菌株生长曲线的比较 | 第45-46页 |
| 4.2.3 各菌株 7-DHC产量的比较 | 第46-47页 |
| 4.3 固醇类代谢产物的鉴定和分析 | 第47-53页 |
| 4.3.1 固醇类产物的推断及鉴定 | 第47-49页 |
| 4.3.2 后鲨烯路径优化菌株的产物差异性分析 | 第49-50页 |
| 4.3.3 7-DHC合成路径关键基因代谢模块的确定 | 第50-53页 |
| 4.4 小结 | 第53-54页 |
| 第五章 外源基因其他表达方法的设计及初探 | 第54-71页 |
| 5.1 生物合成中的其他表达方法 | 第54-56页 |
| 5.1.1 无细胞反应体系 | 第54-56页 |
| 5.1.2 生物体内表达提取和体外酶促反应相结合 | 第56页 |
| 5.2 外源基因的无细胞体系表达初探 | 第56-65页 |
| 5.2.1 无细胞Pure System反应体系 | 第56-57页 |
| 5.2.2 DBAT和LXYL基因的选取及设计 | 第57-60页 |
| 5.2.3 DBAT的体外蛋白表达初探 | 第60-62页 |
| 5.2.4 DBAT和LXYL的融合蛋白体外表达初探 | 第62-65页 |
| 5.3 外源基因的体内表达及体外酶促反应方法初探 | 第65-70页 |
| 5.3.1 表达菌株的构建 | 第65页 |
| 5.3.2 蛋白表达检测 | 第65-69页 |
| 5.3.3 外源基因的体外酶促反应初探 | 第69页 |
| 5.3.4 产物的初步测定和巴卡亭III的生成 | 第69-70页 |
| 5.4 小结 | 第70-71页 |
| 第六章 结论与展望 | 第71-73页 |
| 6.1 结论 | 第71页 |
| 6.2 展望 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-78页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第78-79页 |
| 附录 | 第79-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
