| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-27页 |
| 1.1 ASN的概述 | 第15-17页 |
| 1.1.1 ASN的来源 | 第15页 |
| 1.1.2 ASN的酶学特性 | 第15-16页 |
| 1.1.3 ASN的应用 | 第16-17页 |
| 1.2 ASN的生产 | 第17-18页 |
| 1.2.1 野生菌发酵 | 第17页 |
| 1.2.2 重组菌发酵 | 第17-18页 |
| 1.3 ASN的分子改造 | 第18-22页 |
| 1.3.1 ASN的晶体结构 | 第18-19页 |
| 1.3.2 ASN的催化机理 | 第19-20页 |
| 1.3.3 ASN的应用缺陷及分子改造 | 第20-22页 |
| 1.4 B.subtilis的简介 | 第22-24页 |
| 1.4.1 影响表达的元件的简介 | 第22页 |
| 1.4.2 启动子 | 第22-23页 |
| 1.4.3 非翻译区 | 第23页 |
| 1.4.4 N端密码子 | 第23页 |
| 1.4.5 信号肽 | 第23-24页 |
| 1.4.6 成熟酶N端改造 | 第24页 |
| 1.4.7 宿主改造 | 第24页 |
| 1.5 选题的立题依据、研究意义及主要研究内容 | 第24-27页 |
| 1.5.1 选题的立题依据、研究意义 | 第24-25页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 表达元件改造促进天冬酰胺酶分泌表达 | 第27-43页 |
| 2.1 前言 | 第27页 |
| 2.2 材料与方法 | 第27-34页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.3 培养基 | 第28-29页 |
| 2.2.4 分子生物学操作 | 第29页 |
| 2.2.5 质粒构建 | 第29-32页 |
| 2.2.6 培养条件 | 第32页 |
| 2.2.7 分析方法 | 第32-34页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第34-42页 |
| 2.3.1 启动子替换 | 第34-35页 |
| 2.3.2 启动子优化重组菌中ASN的表达 | 第35-36页 |
| 2.3.3 启动子突变EP-PCR | 第36-37页 |
| 2.3.4 RT-PCR分析转录水平 | 第37页 |
| 2.3.5 序列比对分析筛选强启动子DNA序列变化 | 第37-38页 |
| 2.3.6 5’UTR优化 | 第38-39页 |
| 2.3.7 5’UTR结合能及初始翻译速率分析 | 第39-40页 |
| 2.3.8 5’UTR长度优化 | 第40-41页 |
| 2.3.9 理性设计5’UTR高ASN的表达水平 | 第41-42页 |
| 2.4 本章小节 | 第42-43页 |
| 第三章 N端缺失促进天冬酰胺酶分泌表达 | 第43-56页 |
| 3.1 前言 | 第43页 |
| 3.2 材料与方法 | 第43-47页 |
| 3.2.1 菌株 | 第43页 |
| 3.2.2 培养基 | 第43页 |
| 3.2.3 试剂和仪器 | 第43-44页 |
| 3.2.4 分子生物学操作 | 第44页 |
| 3.2.5 序列比对 | 第44页 |
| 3.2.6 突变质粒的构建 | 第44-45页 |
| 3.2.7 重组ASN的生产 | 第45页 |
| 3.2.8 重组ASN的纯化 | 第45-46页 |
| 3.2.9 分析方法 | 第46-47页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第47-55页 |
| 3.3.1 N端测序及结构分析 | 第47-48页 |
| 3.3.2 N端缺失高ASN表达水平 | 第48-49页 |
| 3.3.3 3L及50L罐发酵放大 | 第49-50页 |
| 3.3.4 N端缺失突变体性质比较 | 第50-51页 |
| 3.3.5 食品应用评估 | 第51-52页 |
| 3.3.6 圆二色谱分析野生酶及其突变体的二级结构 | 第52-53页 |
| 3.3.7 稳态荧光光谱分析野生酶及其突变体的三级结构 | 第53页 |
| 3.3.8 N端影响ASN表达水平的原因分析 | 第53-55页 |
| 3.4 本章小节 | 第55-56页 |
| 第四章 N端高柔性loop改造强化天冬酰胺酶催化活性 | 第56-70页 |
| 4.1 前言 | 第56页 |
| 4.2 材料与方法 | 第56-60页 |
| 4.2.1 菌株 | 第56-57页 |
| 4.2.2 培养基 | 第57页 |
| 4.2.3 试剂和仪器 | 第57页 |
| 4.2.4 计算分析 | 第57-58页 |
| 4.2.5 分子操作 | 第58页 |
| 4.2.6 质粒构建 | 第58-59页 |
| 4.2.7 重组ASN的生产 | 第59页 |
| 4.2.8 重组ASN的纯化 | 第59页 |
| 4.2.9 分析方法 | 第59-60页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第60-69页 |
| 4.3.1 ASN结构模拟 | 第60-61页 |
| 4.3.2 序列比对分析ASNN端结构 | 第61页 |
| 4.3.3 N端loop替换高ASN催化效率 | 第61-63页 |
| 4.3.4 N端loop替换突变体柔性分析 | 第63页 |
| 4.3.5 定点饱和突变进一步高ASN催化效率 | 第63-64页 |
| 4.3.6 突变体酶学性质分析 | 第64-65页 |
| 4.3.7 圆二色谱分析野生ASN及突变体的二级结构 | 第65页 |
| 4.3.8 稳态荧光光谱分析野生ASN及突变体的三级结构 | 第65页 |
| 4.3.9 结构分析 | 第65-66页 |
| 4.3.10 活性位点之间的相互作用分析 | 第66-67页 |
| 4.3.11 C端loop替换高ASN催化效率 | 第67-69页 |
| 4.4 本章小节 | 第69-70页 |
| 第五章 N端高柔性loop改造高天冬酰胺酶耐降解能力 | 第70-83页 |
| 5.1 前言 | 第70页 |
| 5.2 材料与方法 | 第70-72页 |
| 5.2.1 菌株 | 第70页 |
| 5.2.2 培养基 | 第70-71页 |
| 5.2.3 试剂和仪器 | 第71页 |
| 5.2.4 计算分析 | 第71页 |
| 5.2.5 分子操作 | 第71页 |
| 5.2.6 饱和突变文库质粒构建 | 第71页 |
| 5.2.7 重组ASN的生产 | 第71-72页 |
| 5.2.8 重组ASN的纯化 | 第72页 |
| 5.2.9 分析方法 | 第72页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第72-81页 |
| 5.3.1 分离纯化分析不同发酵时间的L6-A26N/G29F的比酶活 | 第72-73页 |
| 5.3.2 N端测序及结构分析 | 第73-74页 |
| 5.3.3 N端缺失分析N端功能 | 第74-75页 |
| 5.3.4 ASN产生双条带原因的分析 | 第75-77页 |
| 5.3.5 分子改造突变关键残基高抗降解能力 | 第77-78页 |
| 5.3.6 蛋白酶处理分析比较突变体抗降解能力 | 第78-79页 |
| 5.3.7 圆二色谱分析野生ASN及其突变体的二级结构 | 第79-80页 |
| 5.3.8 稳态荧光光谱分析野生ASN及突变体的三级结构 | 第80页 |
| 5.3.9 结构分析 | 第80页 |
| 5.3.10 突变体柔性分析 | 第80-81页 |
| 5.4 本章小节 | 第81-83页 |
| 第六章 催化相关loop改造抑制天冬酰胺酶谷氨酰胺活性 | 第83-97页 |
| 6.1 前言 | 第83页 |
| 6.2 材料与方法 | 第83-86页 |
| 6.2.1 菌株 | 第83-84页 |
| 6.2.2 培养基 | 第84页 |
| 6.2.3 试剂和仪器 | 第84页 |
| 6.2.4 计算分析 | 第84页 |
| 6.2.5 分子操作 | 第84页 |
| 6.2.6 质粒构建 | 第84-85页 |
| 6.2.7 重组ASN的生产 | 第85页 |
| 6.2.8 重组ASN的纯化 | 第85页 |
| 6.2.9 分析方法 | 第85-86页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第86-96页 |
| 6.3.1 结构模拟及分析ASN底物口袋结构 | 第86-87页 |
| 6.3.2 序列比对分析ASN底物口袋关键loop序列差异 | 第87页 |
| 6.3.3 分子改造loop2降低ASN的谷氨酰胺相对活性 | 第87-88页 |
| 6.3.4 Loop2区域结构分析 | 第88-89页 |
| 6.3.5 分子改造loop5抑制ASN的谷氨酰胺活性 | 第89-91页 |
| 6.3.6 Loop5区域结构分析 | 第91-92页 |
| 6.3.7 分子改造loop3抑制ASN的谷氨酰胺活性 | 第92-94页 |
| 6.3.8 Loop3区域结构分析 | 第94-95页 |
| 6.3.9 圆二色谱分析野生ASN及突变体的二级结构 | 第95-96页 |
| 6.3.10 稳态荧光光谱分析野生ASN及突变体的三级结构 | 第96页 |
| 6.4 本章小节 | 第96-97页 |
| 主要结论与展望 | 第97-99页 |
| 论文主要创新点 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-111页 |
| 附录：作者在读博期间发表的论文 | 第111页 |
