| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号缩写 | 第10-11页 |
| 1 绪论 | 第11-19页 |
| 1.1 苯乳酸 | 第11-13页 |
| 1.1.1 PLA的结构 | 第11页 |
| 1.1.2 PLA的性质 | 第11页 |
| 1.1.3 PLA的功能 | 第11-12页 |
| 1.1.4 PLA的应用 | 第12-13页 |
| 1.2 PLA的合成方法 | 第13-15页 |
| 1.2.1 化学方法制备PLA | 第13页 |
| 1.2.2 生物合成法制备PLA | 第13-15页 |
| 1.3 PLA合成途径中的酶 | 第15页 |
| 1.3.1 转氨反应 | 第15页 |
| 1.3.2 还原反应 | 第15页 |
| 1.4 NADH辅酶再生系统 | 第15-16页 |
| 1.4.1 葡萄糖脱氢酶再生NADH | 第15-16页 |
| 1.4.2 甲酸脱氢酶再生NADH | 第16页 |
| 1.5 立题意义和研究内容 | 第16-19页 |
| 1.5.1 立题意义 | 第16-18页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-21页 |
| 2.1.1 实验试剂 | 第19页 |
| 2.1.2 实验仪器和设备 | 第19-20页 |
| 2.1.3 菌株与质粒 | 第20页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第20页 |
| 2.1.5 主要溶液的配置 | 第20-21页 |
| 2.2 分子生物学操作 | 第21页 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态的制备 | 第21页 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取 | 第21页 |
| 2.2.3 DNA片段的回收 | 第21页 |
| 2.2.4 酶切和连接 | 第21页 |
| 2.3 分析检测方法 | 第21-23页 |
| 2.3.1 HPLC分析 | 第21-22页 |
| 2.3.2 LDH和FDH酶活力检测方法 | 第22-23页 |
| 2.3.3 蛋白SDS-PAGE分析 | 第23页 |
| 2.4 实验方法 | 第23-35页 |
| 2.4.1 重组质粒pRSF-aad的构建 | 第23-26页 |
| 2.4.2 生物信息学方法筛选乳酸脱氢酶基因ldh | 第26页 |
| 2.4.3 重组质粒pRSF-aad-ldh的构建 | 第26-27页 |
| 2.4.4 最佳乳酸脱氢酶基因ldh的选择 | 第27-28页 |
| 2.4.5 重组质粒pRSF-aad-ldh_(10)-fdh的构建 | 第28-30页 |
| 2.4.6 乳酸脱氢酶LDH10核糖体结合位点(RBS)优化 | 第30-32页 |
| 2.4.7 重组E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)发酵条件优化 | 第32-33页 |
| 2.4.8 重组E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)全细胞转化条件优化 | 第33-34页 |
| 2.4.9 重组E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)菌种稳定性检测 | 第34-35页 |
| 2.5 数据处理与统计分析 | 第35-36页 |
| 3 结果与讨论 | 第36-61页 |
| 3.1 L-氨基酸脱氨酶基因l-aad的克隆表达 | 第36-38页 |
| 3.1.1 L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)的选择 | 第36页 |
| 3.1.2 重组质粒pRSF-aad的构建 | 第36-37页 |
| 3.1.3 重组质粒pRSF-aad的转化和诱导表达 | 第37-38页 |
| 3.2 乳酸脱氢酶LDH的选择及L-AAD和LDH的共表达 | 第38-43页 |
| 3.2.1 生物信息学方法筛选乳酸脱氢酶基因ldh | 第38-40页 |
| 3.2.2 重组质粒pRSF-aad-ldh的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.3 重组质粒pRSF-aad-ldh的转化和诱导表达 | 第41页 |
| 3.2.4 最优LDH的选择 | 第41-42页 |
| 3.2.5 产物PLA的液质验证 | 第42-43页 |
| 3.3 L-AAD、LDH_(10)和FDH的共表达 | 第43-48页 |
| 3.3.1 NADH对重组大肠杆菌BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10))合成PLA的影响 | 第43-44页 |
| 3.3.2 ldh_(10)与fdh的融合 | 第44-46页 |
| 3.3.3 重组质粒pRSF-aad-ldh_(10)-fdh的构建 | 第46-47页 |
| 3.3.4 重组质粒pRSF-aad-ldh_(10)-fdh的转化和诱导表达 | 第47-48页 |
| 3.4 乳酸脱氢酶LDH_(10)核糖体结合位点(RBS)优化 | 第48-51页 |
| 3.4.1 RBS文库构建 | 第48-49页 |
| 3.4.2 最优RBS序列选择 | 第49-51页 |
| 3.5 重组E.coliBL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)发酵条件优化 | 第51-55页 |
| 3.5.1 种龄的优化 | 第51-52页 |
| 3.5.2 接种量的优化 | 第52-53页 |
| 3.5.3 诱导剂浓度的优化 | 第53-54页 |
| 3.5.4 诱导温度和诱导时间的优化 | 第54-55页 |
| 3.6 重组E.coliBL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)全细胞转化条件优化 | 第55-59页 |
| 3.6.1 转化体系pH的优化 | 第55-56页 |
| 3.6.2 转化体系温度的优化 | 第56-57页 |
| 3.6.3 共底物甲酸铵添加量的优化 | 第57-58页 |
| 3.6.4 底物Phe和全细胞催化剂添加比例的优化 | 第58-59页 |
| 3.7 重组E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)稳定性的检测 | 第59-61页 |
| 3.7.1 甘油冻存重组E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)稳定性的检测 | 第59-60页 |
| 3.7.2 重组E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh_(10)-fdh)质粒稳定性的检测 | 第60-61页 |
| 主要结论与展望 | 第61-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-71页 |
| 附录Ⅰ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第71-72页 |
| 附录Ⅱ：相关基因序列 | 第72-73页 |
