纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达
| 中文摘要 | 第1-14页 |
| 英文摘要 | 第14-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-42页 |
| ·溶栓剂的研究和开发 | 第16-19页 |
| ·血栓形成及溶栓机制 | 第16页 |
| ·溶血栓剂 | 第16-19页 |
| ·纳豆激酶的研究现状分析 | 第19-26页 |
| ·纳豆 | 第19-20页 |
| ·纳豆杆菌 | 第20-21页 |
| ·纳豆激酶 | 第21-26页 |
| ·提高纳豆激酶产量的分子生物学基础 | 第26-40页 |
| ·溶血栓剂的基因工程研究 | 第26-27页 |
| ·编码纳豆激酶的基因核苷酸序列的确定 | 第27-28页 |
| ·外源基因在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第28-32页 |
| ·外源基因在酵母中的表达 | 第32-40页 |
| ·本课题研究的内容意义和主要内容 | 第40-42页 |
| ·本课题研究的意义 | 第40页 |
| ·本课题研究的主要内容 | 第40-42页 |
| 第二章 材料与方法 | 第42-60页 |
| ·实验材料 | 第42-48页 |
| ·主要仪器设备 | 第42-43页 |
| ·主要试剂 | 第43-44页 |
| ·菌株和质粒 | 第44页 |
| ·培养基和常用试剂 | 第44-48页 |
| ·实验方法 | 第48-60页 |
| ·纳豆杆菌的分离及活化 | 第48页 |
| ·纳豆激酶的活性测定 | 第48-49页 |
| ·纳豆杆菌生长曲线的测定 | 第49-50页 |
| ·纳豆杆菌总染色体DNA的提取与纯化 | 第50-51页 |
| ·DNA浓度的测定 | 第51页 |
| ·纳豆激酶基因的获得 | 第51-53页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的制备 | 第53-54页 |
| ·DNA的酶切 | 第54页 |
| ·DNA的体外连接 | 第54页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第54页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第54-55页 |
| ·转化子的快速鉴定 | 第55页 |
| ·重组质粒的稳定性测定 | 第55-56页 |
| ·表达产物的酶活性分析 | 第56页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳分析 | 第56页 |
| ·外源基因导入毕赤酵母 | 第56-58页 |
| ·酵母染色体DNA的提取 | 第58页 |
| ·重组酵母中外源基因的稳定性测定 | 第58-59页 |
| ·毕赤酵母中外源基因的甲醇诱导表达 | 第59-60页 |
| 第三章 纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 | 第60-82页 |
| ·不同纳豆杆菌产纳豆激酶的相对活力大小 | 第60-61页 |
| ·纳豆杆菌生长曲线 | 第61页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR)扩增纳豆激酶基因 | 第61-65页 |
| ·引物的设计 | 第62页 |
| ·PCR反应各参数的确定 | 第62-63页 |
| ·纳豆激酶基因的PCR反应 | 第63-65页 |
| ·纳豆激酶基因重组克隆质粒的构建 | 第65-71页 |
| ·pUC19-T载体的构建及纳豆激酶基因的克隆 | 第65页 |
| ·重组子的获得 | 第65-67页 |
| ·重组质粒的限制性内切酶分析及序列测定 | 第67-71页 |
| ·纳豆激酶基因重组表达质粒的构建 | 第71-74页 |
| ·表达载体pBV220 | 第71页 |
| ·重组质粒pBV220-NK的构建 | 第71-73页 |
| ·重组质粒的分析 | 第73-74页 |
| ·基因工程菌生长规律的研究 | 第74-76页 |
| ·基因工程菌的生长曲线测定 | 第74-75页 |
| ·基因工程菌中重组质粒的稳定性 | 第75-76页 |
| ·基因工程菌表达纳豆激酶的研究 | 第76-79页 |
| ·纳豆激酶表达性质的研究 | 第76-77页 |
| ·温控时间对纳豆激酶表达量的影响 | 第77-78页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第78-79页 |
| ·本章小结 | 第79-82页 |
| 第四章 纳豆激酶基因在毕赤酵母细胞中的表达 | 第82-101页 |
| ·酵母表达载体的选择 | 第82页 |
| ·纳豆激酶基因的PCR扩增 | 第82-85页 |
| ·引物的设计 | 第82-84页 |
| ·纳豆激酶基因的PCR扩增 | 第84-85页 |
| ·重组质粒pPICZαA-NK的构建 | 第85-87页 |
| ·重组质粒的限制性内切酶分析及序列测定 | 第87-90页 |
| ·重组质粒的单酶切分析 | 第87页 |
| ·重组质粒的双酶切分析 | 第87页 |
| ·重组质粒的PCR分析 | 第87-88页 |
| ·目的片段的序列测定及分析 | 第88-90页 |
| ·重组转化酵母的获得 | 第90-92页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第90页 |
| ·线性化重组DNA转化酵母细胞 | 第90-91页 |
| ·重组酵母细胞的鉴定 | 第91-92页 |
| ·重组酵母表达外源基因的研究 | 第92-99页 |
| ·重组酵母生长曲线的测定 | 第93-94页 |
| ·重组酵母中外源基因的稳定性研究 | 第94-95页 |
| ·纳豆激酶基因的初步表达研究 | 第95-99页 |
| ·本章小结 | 第99-101页 |
| 结论与展望 | 第101-105页 |
| 结论 | 第101-103页 |
| 展望 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-115页 |
| 在读期间发表论文及所受奖励 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 附录 | 第117-120页 |
