| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略语 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-33页 |
| 1.1 乳糖的应用 | 第15页 |
| 1.2 乳果糖简介 | 第15-17页 |
| 1.2.1 乳果糖的理化性质 | 第15-16页 |
| 1.2.2 乳果糖的功能与应用 | 第16-17页 |
| 1.3 化学法生产乳果糖 | 第17-18页 |
| 1.4 酶法制备乳果糖 | 第18-20页 |
| 1.4.1 β-半乳糖苷酶 | 第18-19页 |
| 1.4.2 β-葡糖苷酶 | 第19页 |
| 1.4.3 纤维二糖差向异构酶 | 第19-20页 |
| 1.5 酶工程技术 | 第20-29页 |
| 1.5.1 酶的固定化 | 第21-22页 |
| 1.5.2 酶的蛋白质工程 | 第22-29页 |
| 1.6 酶的晶体学研究 | 第29-31页 |
| 1.6.1 蛋白质结晶的方法和原理 | 第29-30页 |
| 1.6.2 晶体X射线衍射数据收集 | 第30页 |
| 1.6.3 解决相位问题 | 第30-31页 |
| 1.6.4 晶体结构解析和精修 | 第31页 |
| 1.7 本课题的研究意义及主要内容 | 第31-33页 |
| 1.7.1 研究意义 | 第31-32页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第32-33页 |
| 第二章 KlβGal转糖苷产物结构解析 | 第33-44页 |
| 2.1 引言 | 第33-34页 |
| 2.2 实验材料 | 第34页 |
| 2.2.1 主要试剂 | 第34页 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 | 第34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-36页 |
| 2.3.1 转糖苷反应 | 第34页 |
| 2.3.2 高效液相色谱分析 | 第34页 |
| 2.3.3 转糖苷产物分离纯化 | 第34-35页 |
| 2.3.4 液相/质谱分析 | 第35页 |
| 2.3.5 核磁共振分析 | 第35-36页 |
| 2.4 结果和讨论 | 第36-43页 |
| 2.4.1 反应产物HPLC分离图谱 | 第36-37页 |
| 2.4.2 转糖苷产物结构解析 | 第37-42页 |
| 2.4.3 KlβGal转糖苷反应选择性 | 第42-43页 |
| 2.5 本章小结 | 第43-44页 |
| 第三章 明胶为模板的仿生钙化固定KlβGal | 第44-57页 |
| 3.1 引言 | 第44页 |
| 3.2 实验材料 | 第44-45页 |
| 3.2.1 主要试剂 | 第44-45页 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 | 第45页 |
| 3.3 实验方法 | 第45-48页 |
| 3.3.1 胶囊的制备及酶的固定化 | 第45-46页 |
| 3.3.2 胶囊性质表征 | 第46页 |
| 3.3.3 固定化酶性质测定 | 第46-47页 |
| 3.3.4 固定化酶制备乳果糖 | 第47-48页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第48-56页 |
| 3.4.1 胶囊的制备 | 第48-49页 |
| 3.4.2 胶囊形态结构 | 第49-50页 |
| 3.4.3 胶囊机械稳定性 | 第50-51页 |
| 3.4.4 包埋效率和酶的泄露 | 第51-52页 |
| 3.4.5 最适反应温度 | 第52-53页 |
| 3.4.6 最适反应p H值 | 第53页 |
| 3.4.7 固定化KlβGal重复使用稳定性 | 第53-54页 |
| 3.4.8 固定化KlβGal储存稳定性 | 第54-55页 |
| 3.4.9 固定化KlβGal制备乳果糖 | 第55-56页 |
| 3.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 Cs CE的克隆表达与酶学性质研究 | 第57-74页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 实验材料 | 第57-59页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第57页 |
| 4.2.2 引物 | 第57-58页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第58页 |
| 4.2.4 主要仪器和设备 | 第58页 |
| 4.2.5 培养基配方 | 第58-59页 |
| 4.3 实验方法 | 第59-64页 |
| 4.3.1 编码Cs CE基因的克隆 | 第59页 |
| 4.3.2 核酸电泳鉴定PCR产物 | 第59页 |
| 4.3.3 胶回收PCR产物 | 第59-60页 |
| 4.3.4 目的基因片段与载体双酶切 | 第60页 |
| 4.3.5 目的基因与载体连接反应 | 第60-61页 |
| 4.3.6 连接产物导入克隆宿主 | 第61页 |
| 4.3.7 阳性克隆的鉴定 | 第61页 |
| 4.3.8 重组质粒抽提与验证 | 第61-62页 |
| 4.3.9 重组质粒导入表达宿主 | 第62页 |
| 4.3.10 重组酶蛋白表达 | 第62页 |
| 4.3.11 重组酶蛋白纯化 | 第62-63页 |
| 4.3.12 SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第63页 |
| 4.3.13 重组蛋白酶学性质研究 | 第63-64页 |
| 4.3.14 重组Cs CE制备乳果糖的研究 | 第64页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第64-73页 |
| 4.4.1 Cs CE表达系统构建 | 第64-66页 |
| 4.4.2 重组Cs CE的纯化 | 第66-69页 |
| 4.4.3 重组Cs CE最适温度与p H值 | 第69页 |
| 4.4.4 重组Cs CE半衰期 | 第69-70页 |
| 4.4.5 离子及其它试剂对酶活的影响 | 第70-71页 |
| 4.4.6 酶促反应动力学 | 第71-72页 |
| 4.4.7 重组Cs CE制备乳果糖 | 第72页 |
| 4.4.8 Cs CE催化乳果糖合成途径 | 第72-73页 |
| 4.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 第五章 随机突变提高Cs CE异构化酶活与乳果糖得率 | 第74-84页 |
| 5.1 引言 | 第74页 |
| 5.2 实验材料 | 第74-75页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第74页 |
| 5.2.2 引物 | 第74页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第74页 |
| 5.2.4 主要仪器和设备 | 第74-75页 |
| 5.2.5 培养基配方 | 第75页 |
| 5.3 实验方法 | 第75-78页 |
| 5.3.1 随机突变体库的构建 | 第75-76页 |
| 5.3.2 Cs CE突变体库筛选 | 第76-77页 |
| 5.3.3 酶蛋白表达与纯化 | 第77页 |
| 5.3.4 酶学性质研究 | 第77页 |
| 5.3.5 突变体CsCE制备乳果糖的研究 | 第77-78页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第78-83页 |
| 5.4.1 随机突变体库的构建 | 第78页 |
| 5.4.2 微平板筛选方法 | 第78-79页 |
| 5.4.3 随机突变体库筛选 | 第79-81页 |
| 5.4.4 动力学参数测定 | 第81页 |
| 5.4.5 热失活半衰期 | 第81-82页 |
| 5.4.6 温度和p H值对酶活的影响 | 第82页 |
| 5.4.7 突变体酶制备乳果糖的研究 | 第82-83页 |
| 5.5 本章小结 | 第83-84页 |
| 第六章 Cs CE晶体结构解析与催化机制探究 | 第84-105页 |
| 6.1 引言 | 第84页 |
| 6.2 实验材料 | 第84-85页 |
| 6.2.1 主要试剂 | 第84页 |
| 6.2.2 主要仪器和设备 | 第84-85页 |
| 6.3 实验方法 | 第85-87页 |
| 6.3.1 酶的表达与纯化 | 第85页 |
| 6.3.2 晶体生长条件的筛选 | 第85页 |
| 6.3.3 晶体X射线衍射数据收集与处理 | 第85页 |
| 6.3.4 分子置换法解析晶体结构 | 第85页 |
| 6.3.5 结构模型的精修 | 第85页 |
| 6.3.6 氨基酸序列与晶体结构比对 | 第85页 |
| 6.3.7 定点突变 | 第85-87页 |
| 6.3.8 酶的表达纯化与性质研究 | 第87页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第87-103页 |
| 6.4.1 酶的纯化与结晶 | 第87-89页 |
| 6.4.2 晶体数据收集与处理 | 第89-90页 |
| 6.4.3 分子置换和结构模型精修 | 第90-93页 |
| 6.4.4 Cs CE空间结构 | 第93-94页 |
| 6.4.5 Cs CE催化活性中心推测 | 第94-98页 |
| 6.4.6 催化机制推测 | 第98-101页 |
| 6.4.7 突变体G4-C5结构分析 | 第101-103页 |
| 6.5 本章小结 | 第103-105页 |
| 第七章 定点突变提高Cs CE热稳定性 | 第105-116页 |
| 7.1 引言 | 第105-106页 |
| 7.2 实验材料 | 第106页 |
| 7.2.1 菌株 | 第106页 |
| 7.2.2 主要试剂 | 第106页 |
| 7.2.3 主要仪器 | 第106页 |
| 7.3 实验方法 | 第106-108页 |
| 7.3.1 定点突变 | 第106页 |
| 7.3.2 Po PMu Si C-2.1 分析 | 第106-107页 |
| 7.3.3 酶的表达纯化与性质研究 | 第107页 |
| 7.3.4 圆二色谱 | 第107-108页 |
| 7.3.5 半衰期的测定 | 第108页 |
| 7.4 结果与讨论 | 第108-115页 |
| 7.4.1 理性设计突变体 | 第108-110页 |
| 7.4.2 有益突变的组合 | 第110-111页 |
| 7.4.3 突变体酶的性质研究 | 第111-114页 |
| 7.4.4 圆二色谱分析 | 第114-115页 |
| 7.5 本章小结 | 第115-116页 |
| 主要结论与展望 | 第116-118页 |
| 主要结论 | 第116-117页 |
| 展望 | 第117-118页 |
| 论文创新点 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-127页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第127页 |