| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| ·概述---稀有糖 | 第11页 |
| ·D-阿洛酮糖 | 第11-14页 |
| ·D-阿洛酮糖的结构和理化性质 | 第11-12页 |
| ·D-阿洛酮糖的代谢特性 | 第12页 |
| ·D-阿洛酮糖的生理功能 | 第12-13页 |
| ·D-阿洛酮糖的生物法制备 | 第13-14页 |
| ·D-塔格糖 3-差向异构酶家族酶的研究进展 | 第14-17页 |
| ·DTEase 家族酶的微生物来源 | 第14页 |
| ·DTEase 家族酶的酶学性质 | 第14-16页 |
| ·DTEase 家族酶的蛋白质工程 | 第16页 |
| ·DTEase 家族酶与 D-阿洛酮糖的生产 | 第16-17页 |
| ·枯草芽孢杆菌表达系统 | 第17-19页 |
| ·食品级表达系统 | 第17页 |
| ·枯草芽孢杆菌表达系统 | 第17-18页 |
| ·Cre/lox 定点重组系统 | 第18-19页 |
| ·反向筛选标记重组系统 | 第19页 |
| ·本课题的立题依据和意义 | 第19-20页 |
| ·本课题研究思路与主要内容 | 第20-21页 |
| 第二章 C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 | 第21-41页 |
| ·前言 | 第21页 |
| ·材料与方法 | 第21-27页 |
| ·菌种与质粒 | 第21页 |
| ·培养基 | 第21-22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·主要仪器 | 第23页 |
| ·C. bolteae DTEase 酶基因的克隆 | 第23-25页 |
| ·C. bolteae DTEase 酶基因的表达载体的构建 | 第25-26页 |
| ·C. bolteae DTEase 酶基因在大肠杆菌中表达 | 第26-27页 |
| ·结果与讨论 | 第27-39页 |
| ·C. bolteae DTEase 酶基因的扩增 | 第27-28页 |
| ·PCR 产物的克隆 | 第28-29页 |
| ·C. bolteae DTEase 酶基因的测序及序列分析 | 第29-31页 |
| ·D-阿洛酮糖 3-差向异构酶表达质粒的构建 | 第31-33页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第33-37页 |
| ·重组 E. coli 细胞催化 D-果糖差向异构化反应 | 第37-38页 |
| ·D-阿洛酮糖的鉴定 | 第38-39页 |
| ·本章小结 | 第39-41页 |
| 第三章 C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的分离、纯化及酶学性质研究 | 第41-53页 |
| ·前言 | 第41-42页 |
| ·材料与方法 | 第42-44页 |
| ·菌种及保藏方法 | 第42页 |
| ·主要实验材料 | 第42页 |
| ·主要实验仪器 | 第42页 |
| ·主要实验方法 | 第42-44页 |
| ·结果与讨论 | 第44-52页 |
| ·Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和层析 | 第44-46页 |
| ·Superdex 200 (10/300 GL) 凝胶层析纯化结果 | 第46页 |
| ·Superdex 200 凝胶色谱确定 C. bolteae DPEase 酶的分子量 | 第46-47页 |
| ·金属离子对 C. bolteae DPEase 酶酶活的影响 | 第47-48页 |
| ·C. bolteae DPEase 酶的最适 pH 及 pH 稳定性 | 第48-49页 |
| ·C. bolteae DPEase 酶的最适温度及热稳定性 | 第49-50页 |
| ·C. bolteae DPEase 酶的底物特异性及酶反应动力学参数研究 | 第50-52页 |
| ·C. bolteae DPEase 酶的平衡率 | 第52页 |
| ·本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的催化机理初探及分子改造 | 第53-65页 |
| ·前言 | 第53页 |
| ·材料与方法 | 第53-56页 |
| ·菌种与质粒 | 第53页 |
| ·主要实验仪器 | 第53-54页 |
| ·主要试剂 | 第54页 |
| ·主要实验方法 | 第54-56页 |
| ·结果与讨论 | 第56-64页 |
| ·C. bolteae DPEase 的结构分析及活性位点预测 | 第56-59页 |
| ·改造位点的确定 | 第59页 |
| ·Ala 扫描定点突变 | 第59-60页 |
| ·催化活性中心关键氨基酸 Glu152 和 Glu246 的定点突变 | 第60页 |
| ·底物结合关键氨基酸 Glu158，His188 和 Arg217 的定点突变 | 第60页 |
| ·底物识别关键氨基酸 Y68 和 G109 的定点突变 | 第60-62页 |
| ·Y68 和 G109 位突变体酶的酶学性质 | 第62-63页 |
| ·双突变体酶 Y68I/G109P 的酶学性质研究 | 第63-64页 |
| ·本章小结 | 第64-65页 |
| 第五章 C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第65-74页 |
| ·前言 | 第65页 |
| ·材料与方法 | 第65-67页 |
| ·菌种与质粒 | 第65页 |
| ·主要试剂 | 第65-66页 |
| ·主要仪器 | 第66页 |
| ·主要实验方法 | 第66-67页 |
| ·结果与讨论 | 第67-73页 |
| ·C. bolteae DPEase 酶基因克隆 | 第67-68页 |
| ·B. subtilis 重组表达载体的构建与鉴定 | 第68-69页 |
| ·B. subtilis 重组菌的表达及活性鉴定 | 第69-70页 |
| ·重组 C. bolteae DPEase 酶的分离纯化 | 第70-71页 |
| ·重组 C. bolteae DPEase 酶的酶学性质 | 第71-73页 |
| ·本章小结 | 第73-74页 |
| 第六章 基于 Cre/lox 系统的 C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的食品级表达 | 第74-85页 |
| ·前言 | 第74页 |
| ·材料与方法 | 第74-77页 |
| ·菌种与质粒 | 第74-75页 |
| ·主要试剂 | 第75页 |
| ·主要仪器 | 第75页 |
| ·主要实验方法 | 第75-77页 |
| ·结果与讨论 | 第77-84页 |
| ·重叠 PCR | 第77-78页 |
| ·pP43DPE 载体的克隆 | 第78-79页 |
| ·表达载体 pDGI-7S6 的构建 | 第79-80页 |
| ·表达载体 pDGI-7S6-DPE 的构建 | 第80-81页 |
| ·重组菌 B. Subtilis/7S6-DPE 的构建及筛选 | 第81-82页 |
| ·重组菌 B. subtilis/lox-DPE, pTSC 的构建及筛选 | 第82页 |
| ·重组菌 B. subtilis/lox-DPE 的构建及筛选 | 第82页 |
| ·重组菌 B. subtilis/lox-DPE 的发酵曲线 | 第82-84页 |
| ·本章小结 | 第84-85页 |
| 第七章 基于mazF反向筛选标记的C. bolteae D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因的食品级表达 | 第85-91页 |
| ·前言 | 第85页 |
| ·材料与方法 | 第85-86页 |
| ·菌种与质粒 | 第85页 |
| ·主要试剂 | 第85页 |
| ·主要仪器 | 第85页 |
| ·主要实验方法 | 第85-86页 |
| ·结果与讨论 | 第86-90页 |
| ·表达载体 pDGI-DPE 的构建 | 第86-87页 |
| ·重组菌 B. subtilis/REF 的构建及筛选 | 第87-88页 |
| ·重组菌 B. subtilis/DPE 的构建及筛选 | 第88-89页 |
| ·重组菌 B. subtilis/DPE 的发酵曲线 | 第89-90页 |
| ·本章小结 | 第90-91页 |
| 主要结论与展望 | 第91-93页 |
| 论文创新点 | 第93-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-103页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第103页 |
