| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 缩写符号 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-30页 |
| 1 生命体中的糖类物质简介 | 第16-18页 |
| 1.1 糖类物质的性质及分类 | 第16-17页 |
| 1.2 糖类物质在生命体系中的基本功能 | 第17-18页 |
| 2 生物体内糖链的合成机制的研究与应用 | 第18-19页 |
| 3 糖核苷酸的生物功能及其合成机制 | 第19-20页 |
| 3.1 糖核苷酸的种类与功能 | 第19-20页 |
| 3.2 糖核苷酸的生物合成途径 | 第20页 |
| 4 木糖(Xyl)与UDP-木糖(UDP-Xyl) | 第20-22页 |
| 4.1 木糖(Xyl)的生物学功能 | 第20-21页 |
| 4.2 UDP-木糖(UDP-Xyl)的生物合成途径与功能 | 第21-22页 |
| 4.2.1 UDP-GlcA的生物合成与功能 | 第21-22页 |
| 4.2.2 UDP-Xyl的生物合成与功能 | 第22页 |
| 5 UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD)和UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶(UXS) | 第22-27页 |
| 5.1 UGD的生化功能与研究进展 | 第22-24页 |
| 5.2 UXS的生化功能与研究进展 | 第24-26页 |
| 5.3 酶法合成UDP-GlcA、UDP-Xyl及其寡糖化合物的研究进展 | 第26-27页 |
| 6 嗜热菌Rhodothermus marinus及相关研究简介 | 第27-28页 |
| 7 本文立项依据与研究内容 | 第28-30页 |
| 第二章 RmUGD1、RmUGD2与RmUXS的克隆表达与序列分析 | 第30-48页 |
| 1 材料与方法 | 第30-38页 |
| 1.1 材料 | 第30-31页 |
| 1.1.1 菌种 | 第30页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第30-31页 |
| 1.1.3 培养基 | 第31页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第31页 |
| 1.2 方法 | 第31-38页 |
| 1.2.1 细菌基因组DNA的提取 | 第31-32页 |
| 1.2.2 PCR引物 | 第32页 |
| 1.2.3 PCR反应体系与程序 | 第32页 |
| 1.2.4 PCR产物回收与纯化 | 第32-33页 |
| 1.2.5 DNA产物与PGH测序载体的连接 | 第33-34页 |
| 1.2.6 连接产物的转化 | 第34-35页 |
| 1.2.7 重组质粒的提取与外源DNA插入片段的检测 | 第35-36页 |
| 1.2.8 重组质粒的测序验证 | 第36页 |
| 1.2.9 DNA酶切 | 第36页 |
| 1.2.10 酶切后的DNA片段和pET-30a质粒的回收与纯化 | 第36页 |
| 1.2.11 DNA连接 | 第36-37页 |
| 1.2.12 重组表达质粒的转化 | 第37页 |
| 1.2.13 重组表达质粒的再测序 | 第37-38页 |
| 1.2.14 蛋白质序列结构与进化关系的生物信息学预测分析 | 第38页 |
| 2 结果与分析 | 第38-47页 |
| 2.1 RmUGD1、RmUGD2和RmUXS的PCR扩增与表达载体构建 | 第38-40页 |
| 2.2 RmUGD1、RmUGD2和RmUXS的序列同源比对和结构分析 | 第40-47页 |
| 3 本章小结 | 第47-48页 |
| 第三章 RmUGD1、RmUGD2和RmUXS的原核重组表达及其重组酶活性的检测 | 第48-64页 |
| 1 材料与方法 | 第48-55页 |
| 1.1 材料 | 第48-49页 |
| 1.1.1 菌种 | 第48页 |
| 1.1.2 试剂 | 第48页 |
| 1.1.3 培养基 | 第48-49页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第49页 |
| 1.2 方法 | 第49-55页 |
| 1.2.1 质粒的提取 | 第49页 |
| 1.2.2 质粒的转化 | 第49-50页 |
| 1.2.3 重组蛋白质的体外表达与纯化 | 第50-51页 |
| 1.2.4 重组蛋白质的SDS-PAGE电泳检测 | 第51-52页 |
| 1.2.5 蛋白酶纯化后的脱盐处理和冻干 | 第52页 |
| 1.2.6 酶活测试的反应体系 | 第52-53页 |
| 1.2.7 酶反应产物的UPLC检测分析 | 第53页 |
| 1.2.8 RmUXS反应过程的原位核磁共振(in situ NMR)检测分析 | 第53-54页 |
| 1.2.9 RmUXS酶反应产物的MALDI-TOF质谱分析 | 第54页 |
| 1.2.10 Bradford法蛋白定量试验 | 第54-55页 |
| 2 结果与分析 | 第55-62页 |
| 2.1 RmUGD1和RmUGD2的体外表达与纯化 | 第55-56页 |
| 2.2 UPLC方法验证RmUGD1和RmUGD2的酶活性 | 第56页 |
| 2.3 RmUXS的体外表达与纯化 | 第56-57页 |
| 2.4 UPLC方法验证RmUXS的酶活性 | 第57-58页 |
| 2.5 原位核磁共振(in situ NMR)对RmUXS反应过程的实时检测 | 第58-60页 |
| 2.6 MALDI-TOF质谱测定RmUXS反应产物UDP-Xy1 | 第60-61页 |
| 2.7 RmUGD1和RmUXS的蛋白质定量 | 第61-62页 |
| 3 讨论 | 第62-63页 |
| 4 本章小结 | 第63-64页 |
| 第四章 原核重组表达RmUGD1和RmUXS的酶生化特性测定 | 第64-78页 |
| 1 材料与方法 | 第64-67页 |
| 1.1 材料 | 第64-65页 |
| 1.1.1 试剂 | 第64页 |
| 1.1.2 主要仪器设备 | 第64-65页 |
| 1.2 方法 | 第65-67页 |
| 1.2.1 最适酶反应pH的测定 | 第65页 |
| 1.2.2 最适酶反应温度的测定 | 第65-66页 |
| 1.2.3 金属离子对酶活性的影响测定 | 第66页 |
| 1.2.4 UDP-Xy1对RmUGD1的抑制效果测定 | 第66页 |
| 1.2.5 酶的耐盐性测定 | 第66页 |
| 1.2.6 其他相关因子对酶活性的影响测定 | 第66页 |
| 1.2.7 酶的热稳定性测定 | 第66页 |
| 1.2.8 酶的Km、最大反应速度与酶活力等反应参数的测定 | 第66-67页 |
| 1.2.9 酶反应产物的UPLC分析 | 第67页 |
| 2 结果与分析 | 第67-74页 |
| 2.1 酶最适反应pH的测定 | 第67-68页 |
| 2.2 最适反应温度的测定 | 第68-69页 |
| 2.3 金属离子对酶活性的影响 | 第69-70页 |
| 2.4 UDP-Xy1对RmUGD1的抑制效果测定 | 第70-71页 |
| 2.5 酶的耐盐性的测定 | 第71-72页 |
| 2.6 辅酶和底物类似物等对酶活的影响 | 第72页 |
| 2.7 酶的热稳定性研究 | 第72-73页 |
| 2.8 酶的Km值、最大反应速率与酶活力等 | 第73-74页 |
| 3 讨论 | 第74-77页 |
| 4 本章小结 | 第77-78页 |
| 第五章 一釜法合成(one pot synthesis) UDP-Xy1 | 第78-88页 |
| 1 材料与方法 | 第78-81页 |
| 1.1 材料 | 第78页 |
| 1.1.1 试剂 | 第78页 |
| 1.1.2 主要仪器设备 | 第78页 |
| 1.2 方法 | 第78-81页 |
| 1.2.1 一釜法以UDP-Glc合成UDP-Xy1的预试验检测 | 第78-79页 |
| 1.2.2 一釜法体系中RmUGD1与RmUXS间最佳用量比的测定 | 第79页 |
| 1.2.3 一釜法反应的最适pH值的测定 | 第79页 |
| 1.2.4 一釜法反应的最适温度的测定 | 第79页 |
| 1.2.5 一釜法合成体系的正交试验优化 | 第79-80页 |
| 1.2.6 酶反应产物的UPLC分析 | 第80-81页 |
| 2 结果与分析 | 第81-85页 |
| 2.1 一釜法合成UDP-Xy1的预试验检测 | 第81-82页 |
| 2.2 一釜法反应中RmUGD1和RmUXS的最佳用量比测定 | 第82-83页 |
| 2.3 一釜法反应的最适pH值的测定 | 第83页 |
| 2.4 一釜法反应的最适温度的测定 | 第83-84页 |
| 2.5 一釜法反应体系的正交试验优化 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-86页 |
| 4 本章小结 | 第86-88页 |
| 全文结论 | 第88-90页 |
| 论文创新点 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-102页 |
| 攻读博士期间发表论文情况 | 第102-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
