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红色红曲菌M-7产色素基因簇克隆、解析及代谢途径探讨

摘要第9-12页
Abstract第12-15页
缩略语表第16-17页
第一章 文献综述第17-30页
    1 红曲菌及其代谢产物第17页
    2 MPs第17-22页
        2.1 MPs的种类第18-20页
        2.2 MPs的应用第20页
        2.3 MPs的生物学活性第20-21页
        2.4 MPs代谢合成途径第21-22页
    3 红曲菌功能基因研究情况第22-23页
    4 聚酮化合物和PKS第23-28页
        4.1 聚酮化合物第23页
        4.2 PKS种类及作用机理第23-25页
        4.3 真菌次级代谢产物合成基因簇研究进展第25-27页
            4.3.1 真菌次级代谢产物第25页
            4.3.2 真菌次级代谢产物合成基因簇第25-27页
        4.4 真菌PKS基因克隆方法的研究第27-28页
    5 目的及意义第28-30页
第二章 红曲菌产色素PKS基因簇的克隆及分析第30-47页
    1 材料第30-31页
        1.1 菌株与质粒第30-31页
        1.2 培养基第31页
        1.3 酶与主要试剂及配制第31页
        1.4 主要仪器第31页
    2 方法第31-34页
        2.1 基于KS结构域的PKS进化树的构建第31-32页
        2.2 PKS基因的克隆第32-33页
        2.3 PKS基因侧翼序列的延伸第33-34页
        2.4 PKS基因簇的获得第34页
        2.5 相关基因的生物信息学分析第34页
    3 结果与分析第34-44页
        3.1 基于KS保守结构域的PKS进化树的构建第34-35页
        3.2 PKS基因的克隆第35-36页
        3.3 完整的pksPT基因和MPs基因簇的获得第36页
        3.4 基因簇的生物信息学分析第36-44页
            3.4.1 pksPT的基因结构分析第38-42页
            3.4.2 fasa和fasβ基因结构分析第42-43页
            3.4.3 调节基因pigR基因结构分析第43-44页
    4 小结与讨论第44-47页
        4.1 小结第44-45页
            4.1.1 M-7中色素PKS基因的克隆第44页
            4.1.2 色素PKS基因簇的获得第44页
            4.1.3 基因的结构分析第44-45页
        4.2 讨论第45-47页
            4.2.1 关于pksPT克隆方法的讨论第45页
            4.2.2 关于MPs基因簇的鉴定方法的讨论第45-46页
            4.2.3 关于青霉属中色素合成基因簇的讨论第46-47页
第三章 红曲菌M-7产色素相关基因的功能验证第47-76页
    1 材料第47-48页
        1.1 菌株与质粒第47-48页
        1.2 培养基第48页
        1.3 酶与主要试剂第48页
        1.4 主要仪器第48页
    2 方法第48-56页
        2.1 敲除载体的构建第48-53页
            2.1.1 敲除盒的构建第48-52页
                2.1.1.1 pksPT敲除盒的构建第48-50页
                2.1.1.2 fasα和fasβ敲除盒的构建第50-51页
                2.1.1.3 pigR敲除盒的构建第51-52页
            2.1.2 敲除载体的构建第52-53页
        2.2 农杆菌介导的红曲菌转化第53-54页
        2.3 转化子鉴定第54页
            2.3.1 转化子的PCR检测第54页
            2.3.2 转化子的Southern杂交检验第54页
        2.4 突变子性质分析第54-56页
            2.4.1 红曲菌孢子的收集第54页
            2.4.2 形态观察和显微观察第54-55页
            2.4.3 MPs检测第55页
            2.4.4 生物量和桔霉素产量测定第55-56页
                2.4.4.1 生物量测定第55页
                2.4.4.2 桔霉素产量测定第55-56页
            2.4.5 RT-PCR检测第56页
    3 结果与分析第56-72页
        3.1 敲除载体的构建第56-60页
            3.1.1 pksPT敲除载体的构建第56-58页
            3.1.2 fasα和fasβ敲除载休的构建第58-60页
            3.1.3 pigR敲除载体的构建第60页
        3.2 突变子的鉴定第60-66页
            3.2.1 △pksPT的鉴定第61-63页
            3.2.2 △fasα和△fasβ的鉴定第63-65页
            3.2.3 pigR功能缺失突变子的鉴定第65-66页
        3.3 突变子的性质分析第66-72页
            3.3.1 菌落形态和显微形态观察第66-68页
            3.3.2 MPs分析第68-69页
            3.3.3 生物量比较第69-70页
            3.3.4 产桔霉素能力的比较第70-71页
            3.3.5 RT-PCR检测第71-72页
    4 小结与讨论第72-76页
        4.1 小结第72页
            4.1.1 构建了敲除菌株△pksPT、△fasα、△fasβ和△pigR第72页
            4.1.2 分析了突变子的菌落形态、显微形态和生物量的变化第72页
            4.1.3 评价了突变子产色素和桔霉素能力第72页
        4.2 讨论第72-76页
            4.2.1 关于突变子和出发菌株M-7生物量变化趋势的讨论第72-73页
            4.2.2 脂肪酸合成酶α和β两个亚基在聚酮合成途径中的功能第73-74页
            4.2.3 sFAS的α和β亚基作用机理第74-75页
            4.2.4 关于MPs和桔霉素在代谢合成途径中的关系的讨论第75页
            4.2.5 PKS基因簇簇内调节因子作用机理的讨论第75-76页
第四章 基于trpC启动子表达体系的建立及pigR过表达菌株的构建第76-90页
    1 材料第76-77页
        1.1 菌株与质粒第76-77页
        1.2 酶与主要试剂第77页
        1.3 试剂及培养基配制第77页
        1.4 主要仪器第77页
    2 方法第77-81页
        2.1 trpC启动子调控的pigR表达载体的构建第77-80页
        2.2 农杆菌介导的红曲菌转化第80页
        2.3 转化子的筛选与鉴定第80页
            2.3.1 转化子的PCR方法检测第80页
            2.3.2 转化子的Southern杂交检测第80页
        2.4 性质分析第80-81页
            2.4.1 形态观察和显微观察第80页
            2.4.2 MPs检测第80-81页
            2.4.3 产桔霉素能力比较第81页
            2.4.4 Quantitative real-time PCR第81页
    3 结果与分析第81-88页
        3.1 pigR过表达载体的构建第81-82页
        3.2 过表达菌株的筛选及验证第82-84页
            3.2.1 pigR-complemented△pigR的鉴定第83-84页
            3.2.2 ptrpC::pigR的鉴定第84页
        3.3 过表达菌株性质分析第84-88页
            3.3.1 菌落形态观察第84-85页
            3.3.2 产色素能力分析第85-86页
            3.3.3 桔霉素产量测定第86-87页
            3.3.4 表达量分析第87-88页
    4 小结与讨论第88-90页
        4.1 小结第88-89页
            4.1.1 构建了过表达菌株ptrpC::pigR和回复突变菌株pigR-complemented△pigR第88页
            4.1.2 分析了ptrpC::pigR和pigR-complemented △pigR中色素产量第88页
            4.1.3 分析了ptrpC:pigR和pigR-complemented△pigR桔霉素产量第88页
            4.1.4 分析了pigR敲除菌株和过表达菌株中pksPT、fasα、fasβ和pigR表达量第88-89页
        4.2 讨论第89-90页
            4.2.1 关于ptrpC::pigR和pigR-complemented△pigR中pigR表达量的讨论第89页
            4.2.2 关于ptrpC::pigR和pigR-complemented△pigR中桔霉素产量的讨论第89-90页
第五章 红曲菌中MPs代谢合成途径的探讨第90-102页
    1 材料第90-91页
        1.1 菌株第90-91页
        1.2 主要的试剂及培养基第91页
        1.3 主要仪器第91页
    2 方法第91-93页
        2.1 共培养试验第91页
        2.2 中间产物的提取和分析第91-92页
        2.3 中间产物补充试验第92页
        2.4 ISM分析第92-93页
            2.4.1 菌落形态分析第92页
            2.4.2 色素分析第92页
            2.4.3 产桔霉素能力比较第92页
            2.4.4 生物量比较第92-93页
    3 结果与分析第93-100页
        3.1 共培养试验第93页
        3.2 中间产物的提取和分析第93-95页
        3.3 中间产物补充试验第95-97页
        3.4 ISM性质分析第97-100页
            3.4.1 菌落形态观察第97页
            3.4.2 色素产量测定第97-98页
            3.4.3 桔霉素产量测定第98-99页
            3.4.4 生物量测定第99-100页
    4 小结与讨论第100-102页
        4.1 小结第100页
            4.1.1 获得了一种MPs合成途径中的中间产物第100页
            4.1.2 研究了ISM的生长特性第100页
        4.2 讨论第100-102页
            4.2.1 关于MPs合成中间产物的确定第100页
            4.2.2 关于色素合成途径的讨论第100-102页
第六章 结论与展望第102-105页
    1 结论第102-103页
    2 展望第103-104页
    3 创新点第104-105页
参考文献第105-116页
附录1 红曲菌基因组DNA的抽提第116-118页
附录2 大肠杆菌感受态细胞的转化第118-119页
附录3 质粒DNA的抽提第119-120页
附录4 根癌农杆菌感受态细胞的制备和转化第120-121页
附录5 根癌农杆菌介导的红曲菌转化第121-123页
附录6 Southern杂交第123-127页
附录7 RT-PCR和Realtime qPCR第127-130页
主要成果第130-131页
致谢第131页

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