| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 文献综述和立项依据 | 第23-57页 |
| 第一节 降钙素的研究概况 | 第23-34页 |
| 1 降钙素的来源 | 第23-27页 |
| 1.1 降钙素的发现 | 第23-24页 |
| 1.2 降钙素的生产 | 第24-27页 |
| 2 降钙素的生物特性 | 第27-31页 |
| 2.1 生物活性 | 第27-28页 |
| 2.2 降钙素的分子结构与生物活性的关系 | 第28-31页 |
| 3 hsCT分子的概况 | 第31-32页 |
| 3.1 hsCT的分子结构 | 第31-32页 |
| 3.2 hsCT的等电点pI值、亲水性和疏水性分析 | 第32页 |
| 3.3 hsCT的抗原表位 | 第32页 |
| 4 降钙素的研究展望 | 第32-34页 |
| 第二节 酿酒酵母rDNA的结构及其介导整合影响因素的研究进展 | 第34-49页 |
| 1 酿酒酵母同源重组研究概况 | 第34页 |
| 2 rDNA作为酿酒酵母同源重组位点的研究 | 第34-35页 |
| 3 酿酒酵母rDNA序列元件组成及功能 | 第35-39页 |
| 3.1 rDNA序列组成元件及功能 | 第35-37页 |
| 3.2 rDNA序列35S启动子组成元件及功能 | 第37-39页 |
| 4 影响酿酒酵母rDNA的因素 | 第39-48页 |
| 4.1 影响rDNA的重要功能元件 | 第39-43页 |
| 4.2 酿酒酵母rDNA重复单元拷贝数的影响因素 | 第43-45页 |
| 4.3 酿酒酵母rDNA重复单元稳定性的影响因素 | 第45-47页 |
| 4.4 以rDNA高拷贝数整合的外源基因在有丝分裂中稳定性的影响因素 | 第47-48页 |
| 5 展望 | 第48-49页 |
| 第三节 转基因食品的安全性评价研究 | 第49-55页 |
| 1 转基因食品的概况 | 第49页 |
| 2 转基因食品的安全问题 | 第49-50页 |
| 3 转基因食品的安全性评价 | 第50-51页 |
| 3.1 营养评价 | 第50页 |
| 3.2 致敏性检测 | 第50-51页 |
| 3.3 毒理学评价 | 第51页 |
| 4 食品安全性评价的应用 | 第51-55页 |
| 4.1 食品安全性评价在转基因动物中的应用 | 第51-52页 |
| 4.2 食品安全性评价在转基因植物中的应用 | 第52-53页 |
| 4.3 食品安全性评价在转基因微藻中的应用 | 第53页 |
| 4.4 食品安全性评价在转基因酵母中的应用 | 第53-55页 |
| 第四节 立项依据 | 第55-57页 |
| 1 5hsCT基因的构建及表达研究 | 第55页 |
| 2 以rDNA介导降钙素基因在酿酒酵母中的表达 | 第55-56页 |
| 3 人/鲑嵌合降钙素串联基因在酿酒酵母中表达 | 第56-57页 |
| 第二章 转5hsCT基因酿酒酵母的检测分析 | 第57-98页 |
| 第一节 5hsCT基因向酿酒酵母的转化和检测 | 第57-74页 |
| 1 前言 | 第57-58页 |
| 2 材料 | 第58-60页 |
| 2.1 质粒和菌株 | 第58页 |
| 2.2 培养基 | 第58-59页 |
| 2.3 常用试剂 | 第59-60页 |
| 2.4 主要仪器设备 | 第60页 |
| 3 方法 | 第60-66页 |
| 3.1 rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1线性片段的获得 | 第60-61页 |
| 3.2 酿酒酵母感受态细胞的制备 | 第61页 |
| 3.3 酿酒酵母的转化操作 | 第61-62页 |
| 3.4 转化子的筛选和遗传稳定性检测 | 第62-63页 |
| 3.5 提取转基因酿酒酵母基因组DNA | 第63页 |
| 3.6 Southern blotting实验 | 第63-66页 |
| 4 结果 | 第66-71页 |
| 4.1 rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1线性片段的获得 | 第66-67页 |
| 4.2 酿酒酵母转化子的筛选和稳定性检测 | 第67-69页 |
| 4.3 酿酒酵母转化子的Southem blotting检测 | 第69-71页 |
| 5 讨论 | 第71-74页 |
| 5.1 各种因素对转化率的影响 | 第71-72页 |
| 5.2 转化子稳定性的影响因素 | 第72页 |
| 5.3 Southern blotting检测 | 第72-74页 |
| 第二节 人/鲑嵌合降钙素在酿酒酵母中表达的定性和定量分析 | 第74-89页 |
| 1 前言 | 第74页 |
| 2 材料 | 第74-77页 |
| 2.1 菌种 | 第74-75页 |
| 2.2 溶液及试剂 | 第75-77页 |
| 2.3 实验仪器 | 第77页 |
| 3 方法 | 第77-82页 |
| 3.1 转基因酿酒酵母的培养 | 第77-78页 |
| 3.2 酿酒酵母总蛋白的提取 | 第78页 |
| 3.3 可溶性总蛋白质含量的测定 | 第78-79页 |
| 3.4 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳 | 第79-80页 |
| 3.5 Western Blotting | 第80-81页 |
| 3.6 免疫检测 | 第81页 |
| 3.7 酶联免疫吸附测定 | 第81-82页 |
| 4 结果 | 第82-86页 |
| 4.1 转基因酿酒酵母YS-5hsCT总蛋白含量的测定 | 第82-83页 |
| 4.2 人/鲑嵌合降钙素的表达与定性分析 | 第83-85页 |
| 4.3 人/鲑嵌合降钙素的表达与定量分析 | 第85-86页 |
| 5 讨论 | 第86-89页 |
| 5.1 Western blotting结果分析 | 第86-87页 |
| 5.2 ELISA结果分析 | 第87-89页 |
| 第三节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的降血钙活性研究 | 第89-98页 |
| 1 前言 | 第89页 |
| 2 材料 | 第89-90页 |
| 2.1 实验动物 | 第89页 |
| 2.2 实验菌株 | 第89页 |
| 2.3 培养基 | 第89页 |
| 2.4 常用实验仪器 | 第89-90页 |
| 3 方法 | 第90-92页 |
| 3.1 酿酒酵母的培养 | 第90页 |
| 3.2 转基因酿酒酵母的收集 | 第90页 |
| 3.3 动物实验设计 | 第90-91页 |
| 3.4 小鼠取血和血清的制备 | 第91页 |
| 3.5 血钙值的检测 | 第91-92页 |
| 3.6 统计方法 | 第92页 |
| 4 结果 | 第92-95页 |
| 4.1 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠状态的影响 | 第92页 |
| 4.2 小鼠血钙值的数据处理 | 第92-93页 |
| 4.3 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的持续降血钙活性 | 第93-95页 |
| 4.4 剂量效应 | 第95页 |
| 5 讨论 | 第95-98页 |
| 5.1 真空冷冻干燥对转基因酿酒酵母的影响 | 第95-96页 |
| 5.2 取血方法对血清的影响 | 第96-97页 |
| 5.3 转基因酿酒酵母的降血钙活性效果 | 第97-98页 |
| 第三章 5hsCT在转基因酿酒酵母YS-5hsCT中表达条件的优化 | 第98-132页 |
| 第一节 不同条件对5hsCT基因在转基因酿酒酵母YS-5hsCT中表达的影响 | 第98-116页 |
| 1 前言 | 第98页 |
| 2 材料 | 第98-99页 |
| 2.1 菌株与培养基 | 第98页 |
| 2.2 主要试剂 | 第98-99页 |
| 2.4 主要仪器 | 第99页 |
| 3 方法 | 第99-105页 |
| 3.1 转基因酿酒酵母种子液的培养 | 第99-100页 |
| 3.2 转基因酿酒酵母培养的时间梯度设置 | 第100页 |
| 3.3 转基因酿酒酵母培养的温度梯度设置 | 第100页 |
| 3.4 转基因酿酒酵母培养的转速梯度设置 | 第100-101页 |
| 3.5 酿酒酵母总RNA的提取 | 第101-103页 |
| 3.7 Real-time PCR | 第103-104页 |
| 3.8 基因相对表达量的数据处理 | 第104页 |
| 3.9 酵母总蛋白的提取 | 第104页 |
| 3.10 可溶性总蛋白质含量的测定 | 第104-105页 |
| 3.11 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳 | 第105页 |
| 3.12 酶联免疫吸附测定 | 第105页 |
| 4 结果与分析 | 第105-114页 |
| 4.1 不同条件处理后酿酒酵母总RNA的提取 | 第105页 |
| 4.2 Real-time PCR反应 | 第105-109页 |
| 4.3 不同条件下5hsCT在酿酒酵母中表达的SDS-PAGE分析 | 第109-110页 |
| 4.4 不同条件下人/鲑嵌合降钙素的ELISA测定 | 第110-114页 |
| 5 讨论 | 第114-116页 |
| 5.1 反转录反应对Realtime PCR的影响因素 | 第114页 |
| 5.2 不同条件对5hsCT基因在酿酒酵母中表达的影响 | 第114-116页 |
| 第二节 单因子实验对转基因酿酒酵母YS-5hsCT培养条件的优化 | 第116-126页 |
| 1 前言 | 第116页 |
| 2 材料 | 第116-117页 |
| 2.1 菌株与培养基 | 第116页 |
| 2.2 实验试剂 | 第116页 |
| 2.3 主要仪器 | 第116-117页 |
| 3 方法 | 第117-119页 |
| 3.1 种子液的制备 | 第117页 |
| 3.2 接种量和发酵时间对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第117页 |
| 3.3 温度对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第117-118页 |
| 3.4 搅拌转速对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第118页 |
| 3.5 通气比对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第118页 |
| 3.6 酵母细胞密度及比生长速率的测定 | 第118-119页 |
| 3.7 酵母生物量的测定 | 第119页 |
| 4 结果与分析 | 第119-124页 |
| 4.1 发酵时间对转基因酿酒酵母YS-5hsCT生长的影响 | 第119-120页 |
| 4.2 接种量对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第120-121页 |
| 4.3 温度对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第121-122页 |
| 4.4 搅拌转速对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第122-123页 |
| 4.5 通气量对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第123-124页 |
| 5 讨论 | 第124-126页 |
| 5.1 发酵时间和初始接种量对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第124-125页 |
| 5.2 发酵温度对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第125页 |
| 5.3 发酵搅拌速度和通气量对转基因酿酒酵母生长的影响 | 第125-126页 |
| 第三节 正交实验设计对5hsCT在酿酒酵母YS-5hsCT中表达条件的综合优化 | 第126-132页 |
| 1 前言 | 第126页 |
| 2 材料 | 第126页 |
| 2.1 菌株和培养基 | 第126页 |
| 2.2 常用仪器 | 第126页 |
| 3 方法 | 第126-128页 |
| 3.1 种子液的制备 | 第126-127页 |
| 3.2 正交实验设计 | 第127-128页 |
| 3.3 酵母总蛋白的提取 | 第128页 |
| 3.4 可溶性总蛋白质含量的测定 | 第128页 |
| 3.5 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳 | 第128页 |
| 3.6 酶联免疫吸附测定 | 第128页 |
| 3.7 酵母生物量的测定 | 第128页 |
| 4 结果与分析 | 第128-131页 |
| 4.1 正交实验中5hsCT蛋白表达的SDS-PAGE结果分析 | 第128-129页 |
| 4.2 正交实验中5hsCT蛋白产量的结果分析 | 第129-131页 |
| 5 讨论 | 第131-132页 |
| 第四章 小鼠口服转基因酿酒酵母YS-5hsCT的安全性评价 | 第132-184页 |
| 第一节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT经口急性毒性实验 | 第132-138页 |
| 1 前言 | 第132-133页 |
| 2 材料 | 第133-134页 |
| 2.1 实验动物 | 第133页 |
| 2.2 动物饲料 | 第133页 |
| 2.3 菌株 | 第133-134页 |
| 3 方法 | 第134-136页 |
| 3.1 实验分组 | 第134页 |
| 3.2 实验记录 | 第134-136页 |
| 3.3 LDso的计算公式 | 第136页 |
| 4 结果 | 第136-137页 |
| 5 讨论 | 第137-138页 |
| 第二节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的致突变作用研究Ⅰ | 第138-145页 |
| 1 前言 | 第138页 |
| 2 材料 | 第138-139页 |
| 2.1 实验动物、饲料和菌株 | 第138页 |
| 2.2 主要试剂 | 第138-139页 |
| 2.3 主要仪器 | 第139页 |
| 3 方法 | 第139-141页 |
| 3.1 实验分组 | 第139-140页 |
| 3.2 制作小鼠骨髓细胞涂片 | 第140页 |
| 3.3 涂片镜检 | 第140-141页 |
| 3.4 统计学分析 | 第141页 |
| 4 结果 | 第141-143页 |
| 5 讨论 | 第143-145页 |
| 第三节 转基因酿酒酵母的致突变作用研究Ⅱ | 第145-151页 |
| 1 前言 | 第145页 |
| 2 材料 | 第145页 |
| 2.1 动物、饲料和菌株 | 第145页 |
| 2.2 主要试剂 | 第145页 |
| 2.3 主要仪器 | 第145页 |
| 3 方法 | 第145-147页 |
| 3.1 实验分组 | 第145-146页 |
| 3.2 制作小鼠精子涂片 | 第146页 |
| 3.3 精子畸形检查 | 第146-147页 |
| 3.4 统计学分析 | 第147页 |
| 4 结果 | 第147-150页 |
| 4.1 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠精子畸形的诱导作用 | 第147-148页 |
| 4.2 小鼠精子的畸形类型检查 | 第148-150页 |
| 5 讨论 | 第150-151页 |
| 第四节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的致畸变作用研究 | 第151-166页 |
| 1 前言 | 第151页 |
| 2 材料 | 第151-152页 |
| 2.1 动物、饲料和菌株 | 第151页 |
| 2.2 主要试剂 | 第151-152页 |
| 2.3 主要仪器 | 第152页 |
| 3 方法 | 第152-157页 |
| 3.1 实验分组 | 第152-153页 |
| 3.2 孕鼠的生殖机能检查 | 第153页 |
| 3.3 胎鼠的外观检查 | 第153-154页 |
| 3.4 胎鼠骨骼标本的制作与检查 | 第154-155页 |
| 3.5 胎鼠内脏的畸形检查 | 第155-156页 |
| 3.6 数据统计和分析 | 第156-157页 |
| 4 结果 | 第157-164页 |
| 4.1 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的母体毒性 | 第157-160页 |
| 4.2 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的胚胎发育毒性 | 第160页 |
| 4.3 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对胎鼠外观的致畸影响 | 第160-161页 |
| 4.4 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对胎鼠骨骼的致畸影响 | 第161-163页 |
| 4.5 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对胎鼠各器官、内脏的致畸影响 | 第163-164页 |
| 5 讨论 | 第164-166页 |
| 第五节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的30天喂养实验研究 | 第166-184页 |
| 1 前言 | 第166页 |
| 2 材料 | 第166-167页 |
| 2.1 动物、饲料和菌株 | 第166页 |
| 2.2 主要试剂 | 第166-167页 |
| 2.3 主要仪器 | 第167页 |
| 3 方法 | 第167-170页 |
| 3.1 实验分组 | 第167页 |
| 3.2 血液学和血液生化检查 | 第167-168页 |
| 3.3 病理组织学检查 | 第168页 |
| 3.4 冰冻切片的制备 | 第168-169页 |
| 3.5 冰冻切片的苏木素伊红染色 | 第169-170页 |
| 3.6 统计学分析 | 第170页 |
| 4 结果 | 第170-181页 |
| 4.1 一般观察 | 第170页 |
| 4.2 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠体重的影响 | 第170-171页 |
| 4.3 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠血液常规指标的影响 | 第171-172页 |
| 4.4 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠血液生化指标的影响 | 第172-177页 |
| 4.5 酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠脏器系数的影响 | 第177-179页 |
| 4.6 病理组织检查 | 第179-181页 |
| 5 讨论 | 第181-183页 |
| 5.1 血常规和血液生化检测 | 第181-182页 |
| 5.2 体重变化和脏器系数的影响 | 第182-183页 |
| 6 小结 | 第183-184页 |
| 总结 | 第184-186页 |
| 参考文献 | 第186-208页 |
| 致谢 | 第208-209页 |
| 个人简历 | 第209-210页 |
| 发表的学术论文情况 | 第210页 |
