| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-21页 |
| ·酵母菌酯代谢酶简介 | 第9-16页 |
| ·酵母菌酯代谢途径 | 第9-10页 |
| ·酵母菌酯代谢酶的分类 | 第10-11页 |
| ·酵母酯代谢酶的研究进展 | 第11-16页 |
| ·酯代谢酶EHT1、EEB1、TGL3 的结构和功能 | 第16页 |
| ·大肠杆菌表达系统的研究进展 | 第16-18页 |
| ·表达载体的特点 | 第16-17页 |
| ·外源基因的选择 | 第17页 |
| ·宿主菌的选择 | 第17-18页 |
| ·培养条件的优化 | 第18页 |
| ·毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第18-20页 |
| ·巴斯德毕赤酵母简介 | 第18-19页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 | 第19页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达的培养条件 | 第19-20页 |
| ·课题研究的目的意义 | 第20-21页 |
| 第二章 酵母酯代谢酶EHT1、EEB1、TGL3 原核表达及纯化. | 第21-35页 |
| ·材料 | 第21-24页 |
| ·载体、质粒及表达菌 | 第21页 |
| ·实验主要试剂 | 第21-23页 |
| ·主要仪器 | 第23-24页 |
| ·方法 | 第24-30页 |
| ·蛋白EHT1、EEB1、TGL3 及其表达蛋白生化特性预测 | 第24页 |
| ·质粒提取方法 | 第24页 |
| ·原核表达载体pET28a-EHT1 的构建 | 第24-25页 |
| ·表达引物的设计与目的基因PCR 扩增 | 第25-26页 |
| ·目的基因的回收 | 第26页 |
| ·原核重组表达载体的构建 | 第26-28页 |
| ·重组蛋白转化及重组表达菌的诱导表达 | 第28页 |
| ·重组His-EHT1、His- EEB1、His-TGL3 蛋白纯化 | 第28-29页 |
| ·凝胶蛋白电泳 | 第29页 |
| ·重组蛋白透析及定量 | 第29-30页 |
| ·结果 | 第30-32页 |
| ·三种蛋白及重组表达蛋白的生化特性预测 | 第30页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第30-31页 |
| ·重组菌的诱导表达及蛋白纯化 | 第31-32页 |
| ·讨论 | 第32-34页 |
| ·酯酶蛋白EHT1、EEB1、TGL3 的重组表达 | 第32-33页 |
| ·重组蛋白His-EHT1 和His-EEB1 的表达纯化 | 第33-34页 |
| ·小结 | 第34-35页 |
| 第三章 酵母酯代谢酶EHT1、EEB1、TGL3 真核表达 | 第35-49页 |
| ·材料 | 第35-37页 |
| ·质粒及宿主菌 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35-37页 |
| ·主要仪器 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-42页 |
| ·真核表载体pPIC9k-EHT1 的构建 | 第37-38页 |
| ·细菌质粒提取-碱裂解法 | 第38页 |
| ·表达引物的设计与目的基因PCR 扩增 | 第38页 |
| ·目的基因的回收 | 第38页 |
| ·真核重组表达载体的构建 | 第38-39页 |
| ·连接产物的转化 | 第39页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第39-40页 |
| ·毕赤酵母工程菌G5115/pPIC9k-EHT1/EEB1/TGL3 的构建 | 第40-41页 |
| ·阳性重组子的PCR 鉴定 | 第41-42页 |
| ·三种酯代谢酶在毕赤酵母中的诱导表达 | 第42页 |
| ·发酵液上清中蛋白浓度的测定 | 第42页 |
| ·三种蛋白的糖基化位点预测 | 第42页 |
| ·结果 | 第42-46页 |
| ·三种重组表达载体的鉴定 | 第42-43页 |
| ·毕赤酵母工程菌G5115/pPIC9k-EHT1/EEB1/TGL3 的鉴定 | 第43-44页 |
| ·转化菌株表达产物的电泳检测 | 第44页 |
| ·三种酯代谢酶表达的最佳诱导时间 | 第44-45页 |
| ·三种酯代谢酶糖基化位点预测 | 第45-46页 |
| ·讨论 | 第46-48页 |
| ·酯代谢酶基因真核表达载体的构建 | 第46-47页 |
| ·酯代谢酶蛋白表达的影响因素 | 第47-48页 |
| ·小结 | 第48-49页 |
| 第四章 三种重组酯代谢酶活性研究 | 第49-57页 |
| ·材料 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| ·重组蛋白及重组工程菌 | 第49页 |
| ·方法 | 第49-51页 |
| ·三种酯代谢酶的二级结构预测 | 第49-50页 |
| ·三种酯代谢酶重组蛋白活性测定 | 第50页 |
| ·重组酯代谢酶EHT1 和EEB1 对风味物质的影响 | 第50-51页 |
| ·结果 | 第51-53页 |
| ·三种酯代谢酶的二级结构预测 | 第51-52页 |
| ·三种酯代谢酶重组蛋白的酶活 | 第52页 |
| ·重组酯代谢酶EHT1 和EEB1 对风味物质的影响 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-55页 |
| ·EHT1、EEB1、TGL3 蛋白的结构分析 | 第53-54页 |
| ·不同分子设计的蛋白结构和功能比较 | 第54-55页 |
| ·酯代谢酶EHT1 和EEB1 在酵母代谢中的作用 | 第55页 |
| ·小结 | 第55-57页 |
| 第五章结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 附录1：主要化学试剂 | 第64-65页 |
| 附录2：主要仪器 | 第65-66页 |
| 附录3：缩略词 | 第66-67页 |
| 附录4：EEB1、TGL3 原核重组表达载体构建示意图 | 第67-69页 |
| 附录5：EEB1、TGL3 真核重组表达载体构建 | 第69-71页 |
| 附录6：酵母发酵液SPME-GC-MS 分析图谱结果 | 第71-72页 |
| 发表论文和科研情况说明 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73页 |
