| 摘要 | 第8-13页 |
| ABSTRACT | 第13-18页 |
| 缩略符号说明 | 第19-21页 |
| 第一章 绪论 | 第21-38页 |
| 1.1 酿酒酵母的分泌途径及提高异源蛋白分泌的优化策略 | 第21-28页 |
| 1.1.1 加快新生肽链的易位过程提高异源蛋白的胞外分泌 | 第22-23页 |
| 1.1.2 增加异源蛋白在内质网中的正确折叠 | 第23-24页 |
| 1.1.3 阻断异源蛋白的高甘露糖N-糖基化修饰 | 第24-25页 |
| 1.1.4 增强内质网到高尔基体和高尔基体到质膜间的膜泡运输 | 第25-27页 |
| 1.1.5 降低蛋白的错误分拣及降解 | 第27-28页 |
| 1.2 木质纤维素和纤维素酶结构功能 | 第28-31页 |
| 1.2.1 木质纤维素资源及利用 | 第28页 |
| 1.2.2 纤维素酶的种类和来源 | 第28-29页 |
| 1.2.3 非复合纤维素酶的结构功能 | 第29页 |
| 1.2.4 复合纤维素酶纤维小体的结构功能 | 第29-31页 |
| 1.3 纤维乙醇CBP在酿酒酵母中的研究 | 第31-33页 |
| 1.3.1 非复合型纤维素酶在酿酒酵母中的表达 | 第31页 |
| 1.3.2 人造纤维小体在酿酒酵母细胞表面自组装的研究 | 第31-33页 |
| 1.4 优化酿酒酵母人造纤维小体的结构和功能 | 第33-35页 |
| 1.4.1 人造纤维小体微型支架蛋白的复杂化 | 第33页 |
| 1.4.2 优化纤维小体酶组分的组成和比例 | 第33-34页 |
| 1.4.3 酿酒酵母表面展示系统的种类和应用 | 第34-35页 |
| 1.5 本论文研究意义及主要内容 | 第35-38页 |
| 第二章 实验结果与讨论 | 第38-98页 |
| 2.1 酿酒酵母高活性分泌β-葡萄糖苷酶促进同步糖化发酵生产乙醇 | 第38-46页 |
| 2.1.1 TPI1基因的敲除 | 第39页 |
| 2.1.2 不同来源的β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中的表达 | 第39-40页 |
| 2.1.3 不同信号肽对β-葡萄糖苷酶表达的影响 | 第40-41页 |
| 2.1.4 重组菌株对葡萄糖和纤维二糖的发酵特性 | 第41-43页 |
| 2.1.5 微晶纤维素的同步糖化发酵 | 第43-44页 |
| 2.1.6 酸处理玉米芯的同步糖化发酵 | 第44-45页 |
| 小结与讨论 | 第45-46页 |
| 2.2 改造蛋白折叠和易位过程提高异源蛋白在酿酒酵母中的分泌表达 | 第46-60页 |
| 2.2.1 超表达异源蛋白增加酿酒酵母的代谢负担 | 第46-49页 |
| 2.2.2 改造蛋白折叠过程提高异源蛋白产量 | 第49-51页 |
| 2.2.3 改造蛋白易位过程提高异源蛋白的分泌 | 第51-53页 |
| 2.2.4 信号肽影响蛋白易位改造对异源蛋白的作用 | 第53-54页 |
| 2.2.5 蛋白折叠和易位改造增加异源蛋白产量 | 第54-55页 |
| 2.2.6 改造折叠伴侣和易位组分对异源蛋白分泌的协同作用 | 第55-56页 |
| 2.2.7 蛋白折叠和易位改造增加异源蛋白分泌具有菌株独立性 | 第56-58页 |
| 2.2.8 折叠伴侣和易位组分改造对内源蔗糖酶的影响 | 第58-59页 |
| 小结与讨论 | 第59-60页 |
| 2.3 阻断酿酒酵母高甘露糖糖基化修饰通过上调分泌途径和改变细胞壁完整性增加异源蛋白的产量 | 第60-75页 |
| 2.3.1 异源蛋白在酿酒酵母中被高甘露糖糖基化修饰 | 第60-61页 |
| 2.3.2 敲除糖基转移酶提高异源蛋白的胞外酶活 | 第61-63页 |
| 2.3.3 糖链结构删减没有提高异源蛋白的生物活性 | 第63-65页 |
| 2.3.4 糖基转移酶的敲除提高异源蛋白的产量 | 第65-66页 |
| 2.3.5 敲除OCH1和MNN9增强分泌途径 | 第66-69页 |
| 2.3.5.1 敲除OCH1和MNN9上调分泌途径中的关键分泌元件 | 第66-67页 |
| 2.3.5.2 CFW能增强蛋白分泌途径 | 第67页 |
| 2.3.5.3 OCH1和MNN9敲除没有激活IRE1/HAC1途径 | 第67页 |
| 2.3.5.4 OCH1和MNN9敲除能提高非糖基化蛋白的胞外分泌 | 第67-69页 |
| 2.3.6 敲除OCH1和MNN9破坏细胞壁完整性 | 第69-72页 |
| 2.3.6.1 细胞壁完整性的破坏 | 第69-70页 |
| 2.3.6.2 细胞壁孔隙度增大 | 第70-72页 |
| 2.3.7 OCH1和MNN9敲除菌株生长的回补 | 第72-74页 |
| 2.3.7.1 RHO1和PKC1超表达对菌株生长的影响 | 第72-73页 |
| 2.3.7.2 RHO1和PKC1超表达对细胞壁完整性的影响 | 第73-74页 |
| 小结与讨论 | 第74-75页 |
| 2.4 优化酿酒酵母膜泡运输提高胞外蛋白和表面展示蛋白的分泌量 | 第75-82页 |
| 2.4.1 上调内质网到高尔基体的膜泡运输元件提高异源蛋白胞外活性 | 第75-76页 |
| 2.4.2 超表达高尔基体到质膜的膜泡运输元件促进异源蛋白分泌 | 第76页 |
| 2.4.3 CelA和BGL1在酿酒酵母细胞表面的展示 | 第76-78页 |
| 2.4.5 改造内质网到高尔基体膜泡运输提高异源蛋白表面展示 | 第78-79页 |
| 2.4.6 改造高尔基体到质膜的膜泡运输提高异源蛋白的表面展示 | 第79-80页 |
| 2.4.7 内源性蔗糖酶在膜泡运输改造菌株中的分泌活性 | 第80-81页 |
| 小结与讨论 | 第81-82页 |
| 2.5 酿酒酵母微型纤维小体酶组分的优化及自组装 | 第82-88页 |
| 2.5.1 热纤梭菌初级支架蛋白的表面展示 | 第82-83页 |
| 2.5.2 三种纤维素酶在酿酒酵母中的表达 | 第83-85页 |
| 2.5.3 纤维素酶与支架蛋白的自组装 | 第85-86页 |
| 2.5.4 发酵磷酸膨胀纤维素生产乙醇 | 第86-87页 |
| 小结与讨论 | 第87-88页 |
| 2.6 酿酒酵母通过二硫键自组装新型纤维小体及其复杂化的构制 | 第88-98页 |
| 2.6.1 支架蛋白的表达及检测 | 第89-90页 |
| 2.6.2 与Aga2p融合的纤维素酶在酿酒酵母中的表达 | 第90页 |
| 2.6.3 纤维素酶与支架蛋白的自组装 | 第90-92页 |
| 2.6.3.1 Agalp1-149氨基酸结构域的功能验证 | 第90-92页 |
| 2.6.3.2 纤维素酶与支架蛋白ScafAGA3的自组装 | 第92页 |
| 2.6.4 纤维素酶与支架蛋白的共表达 | 第92-93页 |
| 2.6.5 纤维素酶与支架蛋白的体外组装 | 第93-94页 |
| 2.6.6 酿酒酵母新型纤维小体发酵磷酸膨胀纤维素产生乙醇 | 第94-95页 |
| 2.6.7 纤维小体自组装的复杂化 | 第95-96页 |
| 2.6.8 酿酒酵母复杂化纤维小体对磷酸膨胀纤维素的限氧发酵 | 第96-97页 |
| 小结与讨论 | 第97-98页 |
| 第三章 材料与方法 | 第98-124页 |
| 3.1 材料 | 第98-107页 |
| 3.1.1 质粒与菌株 | 第98-106页 |
| 3.1.2 培养基 | 第106页 |
| 3.1.3 主要酶与试剂 | 第106-107页 |
| 3.1.4 仪器与设备 | 第107页 |
| 3.2 微生物学技术 | 第107-108页 |
| 3.2.1 菌体的生长 | 第107页 |
| 3.2.2 菌种的保存 | 第107-108页 |
| 3.2.3 梯度生长实验 | 第108页 |
| 3.3 分子生物学方法 | 第108-119页 |
| 3.3.1 基因和引物合成测序 | 第108-116页 |
| 3.3.2 PCR反应和琼脂糖凝胶电泳 | 第116页 |
| 3.3.3 DNA切胶回收 | 第116页 |
| 3.3.4 PCR产物与载体质粒的酶切 | 第116页 |
| 3.3.5 质粒构建及转化 | 第116页 |
| 3.3.6 大肠杆菌的质粒提取 | 第116页 |
| 3.3.7 DNA转化酿酒酵母 | 第116-117页 |
| 3.3.8 酵母染色体的提取 | 第117页 |
| 3.3.9 酵母质粒提取 | 第117页 |
| 3.3.10 基因敲除 | 第117页 |
| 3.3.11 酿酒酵母总RNA提取及反转录 | 第117页 |
| 3.3.12 实时荧光定量PCR | 第117-118页 |
| 3.3.13 HAC1 mRNA剪接检测 | 第118页 |
| 3.3.14 蛋白的提取与浓缩 | 第118页 |
| 3.3.15 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第118页 |
| 3.3.16 Western blot检测 | 第118-119页 |
| 3.3.17 ELISA蛋白定量 | 第119页 |
| 3.4 蛋白酶活的检测 | 第119-121页 |
| 3.4.1 β-葡萄糖苷酶酶活检测 | 第119页 |
| 3.4.2 内切葡聚糖酶酶活检测 | 第119-120页 |
| 3.4.3 外切葡聚糖酶酶活检测 | 第120页 |
| 3.4.4 α-淀粉酶酶活检测 | 第120页 |
| 3.4.5 蔗糖酶酶活检测 | 第120页 |
| 3.4.6 纤维素酶滤纸酶活检测 | 第120-121页 |
| 3.5 纤维小体的组装 | 第121页 |
| 3.5.1 对接模块-粘连模块相互作用 | 第121页 |
| 3.5.2 Aga1p和Aga2p间二硫键的形成 | 第121页 |
| 3.6 菌株代谢能力测试 | 第121-122页 |
| 3.6.1 葡萄糖和纤维二糖的发酵 | 第121页 |
| 3.6.2 微晶纤维素和玉米芯的同步糖化发酵 | 第121页 |
| 3.6.3 磷酸膨胀纤维素(PASC)的制备及发酵 | 第121-122页 |
| 3.6.4 代谢产物分析 | 第122页 |
| 3.7 细胞壁完整性检测 | 第122-123页 |
| 3.7.1 刚果红试验 | 第122页 |
| 3.7.2 荧光增白剂Fluorescent Brightener 28(CFW)试验 | 第122页 |
| 3.7.3 Lyticase裂解细胞壁 | 第122页 |
| 3.7.4 细胞孔隙度的检测 | 第122-123页 |
| 3.8 蛋白N-糖链的去除 | 第123-124页 |
| 全文总结与展望 | 第124-128页 |
| 附录 | 第128-139页 |
| 参考文献 | 第139-147页 |
| 攻读学位期间的学术成果 | 第147-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
| 附件 | 第150页 |
