| 目录 | 第1-12页 |
| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-45页 |
| 1 大麦中的β-葡聚糖及其在酿酒过程中的降解 | 第16-26页 |
| ·大麦β-葡聚糖的结构和性质 | 第16-18页 |
| ·可以降解大麦葡聚糖的内源性酶 | 第18-20页 |
| ·β-1,3-1,4-葡聚糖酶 | 第18-20页 |
| ·外切-β-葡聚糖水解酶以及β-葡萄糖苷酶 | 第20页 |
| ·啤酒酿造过程中大麦葡聚糖的降解 | 第20-23页 |
| ·制麦过程中β-葡聚糖的降解 | 第20-21页 |
| ·糖化过程中β-葡聚糖的降解 | 第21-22页 |
| ·发酵过程中添加外源性葡聚糖酶 | 第22-23页 |
| ·β-葡聚糖对酿酒过程中的影响及对策 | 第23-26页 |
| ·培育低含量β-葡聚糖大麦 | 第23-24页 |
| ·添加微生物来源的酶制剂 | 第24-26页 |
| ·构建表达外源β-葡聚糖酶的酿酒酵母菌株 | 第26页 |
| 2 酿酒酵母中的蛋白酶A以及对啤酒酿造的影响 | 第26-37页 |
| ·酿酒酵母的蛋白酶系统 | 第27-29页 |
| ·液泡蛋白酶(Vacuolar proteases) | 第27-28页 |
| ·胞质蛋白酶体(cytosolic proteosome) | 第28页 |
| ·分泌途径的蛋白酶(proteases located along the secretory pathway) | 第28-29页 |
| ·酿酒酵母的蛋白酶A | 第29-30页 |
| ·蛋白酶A的编码 | 第29页 |
| ·酵母蛋白酶A的结构 | 第29-30页 |
| ·蛋白酶A的功能及性质 | 第30-31页 |
| ·蛋白酶A的分泌及加工修饰过程 | 第31-32页 |
| ·PEP4突变对酵母液泡酶系统的影响 | 第32-33页 |
| ·啤酒酿造过程中的蛋白酶A的变化 | 第33-34页 |
| ·蛋白酶A对泡沫稳定性的影响 | 第34-35页 |
| ·降低啤酒中蛋白酶A的途径 | 第35-36页 |
| ·蛋白酶A的测定 | 第36-37页 |
| 3 现代分子生物学技术在酿酒酵母(Sacchaaromyces cerevisiae)育种上的应用—啤酒生产方向 | 第37-43页 |
| ·对淀粉的充分利用 | 第37-38页 |
| ·消除酵母发酵过程中双乙酰的影响 | 第38-39页 |
| ·双乙酰的代谢 | 第38-39页 |
| ·低双乙酰工程菌 | 第39页 |
| ·提高啤酒生产的操作性 | 第39-41页 |
| ·絮凝性的改善 | 第40页 |
| ·β-葡聚糖酶工程菌构建 | 第40-41页 |
| ·改善啤酒泡沫的稳定性 | 第41页 |
| ·改进啤酒风味 | 第41-43页 |
| ·增加啤酒的生香物质 | 第41-42页 |
| ·低H_2S酿酒酵母工程菌的构建 | 第42页 |
| ·低高级醇酿酒酵母 | 第42-43页 |
| ·酿酒酵母基因改造前景展望 | 第43页 |
| 4 选题背景及研究内容 | 第43-45页 |
| 第二章 bg1S表达单元的构建以及在酿酒酵母中的表达 | 第45-66页 |
| 0 前言 | 第45页 |
| 1 材料与方法 | 第45-51页 |
| ·材料、主要试剂及仪器设备 | 第46-47页 |
| ·菌株、质粒、试剂 | 第46页 |
| ·培养基 | 第46页 |
| ·主要试剂及配制 | 第46页 |
| ·主要仪器和设备 | 第46-47页 |
| ·实验方法 | 第47-51页 |
| ·引物的合成 | 第47页 |
| ·PCR扩增 | 第47-48页 |
| ·酶切连接 | 第48页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第48-49页 |
| ·枯草芽孢杆菌基因组提取 | 第49页 |
| ·酵母基因组提取 | 第49-50页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第50页 |
| ·酵母感受态细胞的制备及转化 | 第50-51页 |
| ·酿酒酵母转化子的筛选 | 第51页 |
| ·β-葡聚糖酶活性的测定 | 第51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-60页 |
| ·片断的扩增 | 第51-56页 |
| ·β-葡聚糖酶基因的扩增 | 第51-53页 |
| ·PGK1_P的扩增 | 第53页 |
| ·MFα1_S的扩增 | 第53-55页 |
| ·ADH1_T的扩增 | 第55页 |
| ·KanMX的扩增 | 第55-56页 |
| ·表达单元的构建 | 第56-59页 |
| ·片断PGK1_P、MFα1_S在质粒pUC18中的克隆 | 第56-57页 |
| ·片断bg1S、ADH1_T在质粒pUC18中的克隆 | 第57页 |
| ·bg1S基因表达单元PGK1_P-MFα1_S-bg1S-ADH1_T的形成 | 第57页 |
| ·bg1S基因表达单元与KanMX的连接 | 第57页 |
| ·bg1S基因酿酒酵母表达载体的形成 | 第57页 |
| ·重组质粒的PCR、酶切鉴定 | 第57-59页 |
| ·重组质粒测序 | 第59页 |
| ·质粒的转化以及转化子的筛选 | 第59页 |
| ·β-葡聚糖酶的酶活测定 | 第59-60页 |
| 3 讨论 | 第60-61页 |
| 4 小结 | 第61-66页 |
| 第三章 酿酒酵母中表达的重组β-葡聚糖酶的酶学性质 | 第66-75页 |
| 0 前言 | 第66页 |
| 1 材料与方法 | 第66-69页 |
| ·材料、试剂和仪器 | 第66-67页 |
| ·菌株 | 第66页 |
| ·培养基 | 第66-67页 |
| ·主要试剂 | 第67页 |
| ·仪器 | 第67页 |
| ·实验方法 | 第67-69页 |
| ·β-葡聚糖酶的活性测定方法 | 第67-68页 |
| ·刚果红法 | 第67-68页 |
| ·DNS法 | 第68页 |
| ·葡聚糖标准曲线的绘制 | 第68页 |
| ·β-葡聚糖酶酶学性质的测定 | 第68-69页 |
| ·酶的底物专一性比较 | 第68页 |
| ·β-葡聚糖酶的最适反应温度 | 第68页 |
| ·β-葡聚糖酶的热稳定性 | 第68-69页 |
| ·β-葡聚糖酶最适pH值 | 第69页 |
| ·β-葡聚糖酶pH稳定性 | 第69页 |
| 2 结果与分析 | 第69-73页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第69页 |
| ·酶的底物专一性比较 | 第69-70页 |
| ·最适反应温度 | 第70-71页 |
| ·热稳定性分析 | 第71页 |
| ·最适pH值 | 第71-72页 |
| ·pH稳定性 | 第72-73页 |
| 3 讨论 | 第73-74页 |
| ·重组酵母菌株分泌的β-葡聚糖酶的酶活测定方法 | 第73页 |
| ·重组酶酶学性质的改变 | 第73-74页 |
| 4 小结 | 第74-75页 |
| 第四章 bg1S基因在PEP4位点上的整合表达 | 第75-88页 |
| 0 前言 | 第75页 |
| 1 材料与方法 | 第75-80页 |
| ·材料及主要试剂 | 第75-76页 |
| ·酵母菌株及质粒 | 第75-76页 |
| ·引物 | 第76页 |
| ·培养基 | 第76页 |
| ·工具酶和主要试剂 | 第76页 |
| ·仪器 | 第76-77页 |
| ·实验方法 | 第77-80页 |
| ·替换用DNA片段的扩增 | 第77页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第77页 |
| ·酵母感受态细胞的制备、转化 | 第77-78页 |
| ·转化菌的平板筛选 | 第78-79页 |
| ·基因组DNA提取及重组菌株的PCR鉴定 | 第79页 |
| ·重组菌株的β-葡聚糖酶活测定 | 第79-80页 |
| 2 结果与分析 | 第80-85页 |
| ·替换片断的扩增 | 第80-81页 |
| ·转化以及重组酿酒酵母的筛选 | 第81-82页 |
| ·重组酿酒酵母的PCR鉴定 | 第82-83页 |
| ·重组酿酒酵母的β-葡聚糖酶酶活性测定 | 第83-84页 |
| ·重组酵母菌株的生长性能 | 第84页 |
| ·重组酿酒酵母SC-βG1生长阶段与产酶曲线的对比 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-86页 |
| ·基因替换时位点的随机性 | 第85页 |
| ·重组酿酒酵母菌株的生长速度 | 第85-86页 |
| ·保留一个PEP4等位基因的必要性 | 第86页 |
| 4 小节 | 第86-88页 |
| 第五章 重组菌株中标记基因的删除 | 第88-97页 |
| 0 前言 | 第88页 |
| 1 材料与方法 | 第88-91页 |
| ·菌株和质粒 | 第88页 |
| ·主要试剂和培养基 | 第88-89页 |
| ·主要仪器 | 第89页 |
| ·实验方法和步骤 | 第89-91页 |
| ·pSH-Z质粒的扩增 | 第89页 |
| ·重组酵母感受态的制备及转化 | 第89页 |
| ·转化子的筛选 | 第89页 |
| ·Cre的诱导表达 | 第89-90页 |
| ·Kan~r丢失菌株的筛选 | 第90页 |
| ·Kan~r丢失菌株的PCR鉴定 | 第90页 |
| ·Kan~r丢失菌株的抗性鉴定 | 第90页 |
| ·质粒pSH-Z的传代丢失 | 第90-91页 |
| ·质粒pSH-Z丢失菌株的PCR鉴定 | 第91页 |
| ·重组菌株中bg1S完整性的PCR验证 | 第91页 |
| ·β-葡聚糖酶酶活的测定 | 第91页 |
| 2 结果与分析 | 第91-95页 |
| ·重组质粒pSH-Z的扩增 | 第91-92页 |
| ·转化筛选及Kan~r丢失菌的鉴定 | 第92-94页 |
| ·质粒pSH-Z的传代丢失及鉴定 | 第94-95页 |
| ·β-葡聚糖酶酶活的测定 | 第95页 |
| 3 讨论 | 第95-96页 |
| 4 小节 | 第96-97页 |
| 第六章 重组菌株的发酵性能以及其遗传稳定性 | 第97-108页 |
| 0 前言 | 第97页 |
| 1 材料与方法 | 第97-100页 |
| ·材料及主要试剂 | 第97页 |
| ·仪器 | 第97-98页 |
| ·实验方法 | 第98-100页 |
| ·重组菌及对照菌继代培养 | 第98页 |
| ·重组菌中外源基因的传代稳定性鉴定 | 第98页 |
| ·蛋白酶A活性测定 | 第98-99页 |
| ·β-葡聚糖酶活性测定 | 第99页 |
| ·生长性能试验 | 第99页 |
| ·发酵力试验 | 第99-100页 |
| ·酵母凝聚性试验 | 第100页 |
| ·热死灭温度试验 | 第100页 |
| 2 结果与分析 | 第100-106页 |
| ·抗性丢失的遗传稳定性 | 第100-101页 |
| ·重组菌株传代稳定性的PCR检测 | 第101-102页 |
| ·蛋白酶A活性检测 | 第102-103页 |
| ·β-葡聚糖酶表达的传代稳定性 | 第103-104页 |
| ·生长性能 | 第104-105页 |
| ·发酵力 | 第105页 |
| ·凝聚性 | 第105-106页 |
| ·热死灭温度 | 第106页 |
| 3 讨论 | 第106-107页 |
| ·蛋白酶A的活性变化 | 第106-107页 |
| ·构建蛋白酶A缺失菌株 | 第107页 |
| 4 小节 | 第107-108页 |
| 第七章 重组菌株的酿酒试验 | 第108-113页 |
| 0 前言 | 第108页 |
| 1 材料与方法 | 第108-110页 |
| ·酵母菌株及原料 | 第108页 |
| ·主要仪器 | 第108-109页 |
| ·实验方法 | 第109-110页 |
| ·啤酒酿造试验方法 | 第109页 |
| ·理化指标及性能分析 | 第109-110页 |
| 2 结果与讨论 | 第110-112页 |
| ·各种理化指标测定结果 | 第110页 |
| ·酵母菌性能测试 | 第110-112页 |
| 3 讨论 | 第112页 |
| 4 小结 | 第112-113页 |
| 第八章 主要结论 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-132页 |
| 致谢 | 第132页 |
