| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-35页 |
| ·天然食品防腐剂与细菌素 | 第17-18页 |
| ·天然食品防腐剂的发展需求 | 第17页 |
| ·细菌素的概念与来自乳酸菌的细菌素 | 第17页 |
| ·细菌素的抗菌机制 | 第17-18页 |
| ·细菌素的基因工程 | 第18页 |
| ·乳酸片球菌素(Pediocin)的研究概况 | 第18-19页 |
| ·乳酸片球菌素的理化性质与抑菌活性 | 第18页 |
| ·乳酸片球菌素的生化和基因研究 | 第18-19页 |
| ·乳酸片球菌素转基因研究 | 第19页 |
| ·国内对乳酸片球菌素的研究 | 第19页 |
| ·现代生物技术、重组蛋白质与大肠杆菌表达系统 | 第19-23页 |
| ·关于现代生物技术的一般表述 | 第19-20页 |
| ·基因工程与重组蛋白质 | 第20页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第20-23页 |
| ·外源蛋白在大肠杆菌中表达的相关影响因素 | 第20-23页 |
| ·表达系统E.coli BL21(DE3)/pET | 第23页 |
| ·重组大肠杆菌高密度发酵技术 | 第23-33页 |
| ·重组Escherichia coli高密度培养概述 | 第23-24页 |
| ·重组大肠杆菌构建的影响因素 | 第24-26页 |
| ·宿主菌的选择 | 第24-25页 |
| ·质粒载体 | 第25-26页 |
| ·高密度培养过程中培养基成分及作用与优化设计 | 第26-27页 |
| ·培养基成分的作用 | 第26-27页 |
| ·工程菌高密度培养基优化设计 | 第27页 |
| ·培养条件对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响 | 第27-28页 |
| ·溶氧 | 第27-28页 |
| ·温度 | 第28页 |
| ·pH值 | 第28页 |
| ·高密度培养方式 | 第28-30页 |
| ·非反馈控制补料 | 第29页 |
| ·反馈控制补料 | 第29-30页 |
| ·重组大肠杆菌诱导方式的影响 | 第30-31页 |
| ·抑制性代谢产物乙酸对菌体生长及外源基因表达的影响 | 第31-33页 |
| ·代谢副产物的抑制作用及生成机制 | 第31页 |
| ·控制乙酸生成的策略 | 第31-33页 |
| ·比生长速率的控制 | 第33页 |
| ·本课题研究的主要内容及意义 | 第33-35页 |
| 第二章 乳酸片球菌素的分离纯化与性质鉴定 | 第35-53页 |
| ·引言 | 第35页 |
| ·材料与方法 | 第35-43页 |
| ·仪器与试剂 | 第35-37页 |
| ·主要仪器 | 第35-36页 |
| ·主要试剂 | 第36-37页 |
| ·菌株 | 第37页 |
| ·培养基 | 第37-38页 |
| ·菌种的活化、培养 | 第38页 |
| ·细胞吸附法提取乳酸片球菌素 | 第38页 |
| ·半制备型反相液相色谱RP-HPLC纯化 | 第38页 |
| ·乳酸片球菌素活性的测定 | 第38-39页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第39-40页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE电泳检测乳酸片球菌素 | 第40-41页 |
| ·温度和pH对乳酸片球菌素活性的影响 | 第41页 |
| ·温度对乳酸片球菌素活性的影响 | 第41页 |
| ·pH对乳酸片球菌素活性的影响 | 第41页 |
| ·乳酸片球菌素稳定性的鉴定 | 第41-42页 |
| ·pH对乳酸片球菌素稳定性的影响 | 第41页 |
| ·温度对乳酸片球菌素稳定性的影响 | 第41页 |
| ·乳酸片球菌素浓度对其稳定性的影响 | 第41-42页 |
| ·乳酸片球菌素对粪肠球菌的最低抑菌浓度(MIC)的测定 | 第42页 |
| ·乳酸片球菌素对粪肠球菌(E.faecalis)的时间杀菌曲线的测定 | 第42页 |
| ·来源于纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)的纤维素酶和木聚糖酶的生产与鉴定 | 第42-43页 |
| ·实验结果与讨论 | 第43-51页 |
| ·细胞吸附法、半制备型RP-HPLC分离纯化乳酸片球菌素 | 第43-44页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE电泳检测细胞吸附法分离乳酸片球菌素的结果 | 第44页 |
| ·蛋白浓度与活性测定结果 | 第44-45页 |
| ·乳酸片球菌素的活性 | 第45-46页 |
| ·温度对乳酸片球菌素活性的影响 | 第45页 |
| ·pH对乳酸片球菌素活性的影响 | 第45-46页 |
| ·乳酸片球菌素的稳定性 | 第46-48页 |
| ·pH对乳酸片球菌素稳定性的影响 | 第46-47页 |
| ·温度对乳酸片球菌素稳定性的影响 | 第47页 |
| ·乳酸片球菌素浓度对其稳定性的影响 | 第47-48页 |
| ·乳酸片球菌素对粪肠球菌的最低抑菌浓度(MIC) | 第48页 |
| ·乳酸片球菌素对粪肠球菌的时间杀菌曲线 | 第48页 |
| ·来源于纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)的纤维素酶和木聚糖酶的生产与鉴定 | 第48-51页 |
| ·小结 | 第51-53页 |
| 第三章 融合型乳酸片球菌素在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第53-66页 |
| ·引言 | 第53页 |
| ·材料和方法 | 第53-59页 |
| ·仪器、试剂与材料 | 第53-54页 |
| ·主要仪器 | 第53页 |
| ·试剂与材料 | 第53-54页 |
| ·质粒与菌株 | 第54页 |
| ·实验方法 | 第54-57页 |
| ·质粒的抽提 | 第54-55页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第55页 |
| ·切胶纯化回收DNA片段 | 第55页 |
| ·DNA电泳 | 第55页 |
| ·Tris-SDS-PAGE电泳 | 第55-57页 |
| ·pediocin基因的克隆、表达与产物纯化 | 第57-58页 |
| ·pediocin基因的克隆 | 第57页 |
| ·PED表达质粒的构建 | 第57页 |
| ·质粒转化 | 第57-58页 |
| ·重组菌的培养、诱导表达 | 第58页 |
| ·表达产物的分离纯化 | 第58页 |
| ·蛋白浓度与PED-N表达水平的测定 | 第58-59页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第58页 |
| ·PED-N表达水平的测定 | 第58-59页 |
| ·细菌素活性检定 | 第59页 |
| ·重组质粒pET32c-PED的稳定性 | 第59页 |
| ·结果与讨论 | 第59-65页 |
| ·pediocin基因的克隆 | 第59-60页 |
| ·表达质粒pET32c-PED的构建 | 第60-62页 |
| ·融合型乳酸片球菌素的表达 | 第62-63页 |
| ·重组蛋白的纯化及活性检定 | 第63-64页 |
| ·重组质粒pET32c-PED的稳定性 | 第64-65页 |
| ·本章小结 | 第65-66页 |
| 第四章 重组乳酸片球菌素的表达特性 | 第66-77页 |
| ·引言 | 第66页 |
| ·实验材料与仪器 | 第66-68页 |
| ·仪器、试剂与菌株 | 第66页 |
| ·主要仪器 | 第66页 |
| ·试剂 | 第66页 |
| ·菌株 | 第66页 |
| ·分析方法 | 第66-67页 |
| ·菌浓的测定 | 第66页 |
| ·取样方法 | 第66-67页 |
| ·Tris-SDS-PAGE电泳 | 第67页 |
| ·BL21(DE3)与BL21(DE3)pLysS诱导后生长与表达产率的差异 | 第67页 |
| ·温度对BL21(DE3)与BL21(DE3)pLysS两菌株表达特性的影响 | 第67页 |
| ·IPTG浓度对BL21(DE3)与BL21(DE3)pLysS两菌株表达水平的影响 | 第67页 |
| ·菌体裂解液和包涵体洗涤液组成成分对包涵体溶解性的影响 | 第67-68页 |
| ·尿素浓度对包涵体溶解的影响 | 第68页 |
| ·二硫苏糖醇(DTT)对包涵体溶解的影响 | 第68页 |
| ·结果和讨论 | 第68-75页 |
| ·BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS诱导后细胞生长与PED-N表达产率的差异 | 第68-69页 |
| ·IPTG诱导时间对BL21(DE3)与BL21(DE3)pLysS两菌株表达的影响 | 第69页 |
| ·温度对BL21(DE3)与BL21(DE3)pLysS两菌株表达的影响 | 第69-71页 |
| ·IPTG浓度对BL21(DE3)与BL21(DE3)pLysS两菌株表达的影响 | 第71-72页 |
| ·菌体裂解液和包涵体洗涤液组成成分对包涵体溶解性的影响 | 第72-73页 |
| ·尿素浓度对融合蛋白PED-N包涵体溶解性的影响 | 第73-74页 |
| ·DTT对融合蛋白PED-N包涵体溶解性的影响 | 第74-75页 |
| ·本章小结 | 第75-77页 |
| 第五章 高密度培养重组大肠杆菌表达融合型乳酸片球菌素 | 第77-92页 |
| ·引言 | 第77页 |
| ·材料与方法 | 第77-81页 |
| ·仪器、试剂、菌株与培养基 | 第77-78页 |
| ·主要仪器 | 第77页 |
| ·试剂 | 第77页 |
| ·菌株 | 第77页 |
| ·培养基 | 第77-78页 |
| ·分析方法 | 第78-79页 |
| ·菌浓的测定 | 第78页 |
| ·PED-产率的测定 | 第78页 |
| ·乙酸含量的测定 | 第78-79页 |
| ·甘油浓度的测定 | 第79页 |
| ·高密度培养过程中工程菌的稳定性分析 | 第79页 |
| ·E.coli BL21/pET32c-PED高表达菌株的活化与筛选 | 第79页 |
| ·摇瓶发酵条件优化 | 第79-80页 |
| ·培养基的筛选 | 第79-80页 |
| ·培养基碳源浓度优化 | 第80页 |
| ·培养基氮源浓度优化 | 第80页 |
| ·pH值优化 | 第80页 |
| ·诱导条件优化 | 第80页 |
| ·诱导剂乳糖浓度 | 第80页 |
| ·诱导温度 | 第80页 |
| ·诱导后表达时间 | 第80页 |
| ·诱导剂加入方式 | 第80页 |
| ·高密度发酵条件的优化 | 第80-81页 |
| ·培养方法 | 第80页 |
| ·溶氧浓度的优化 | 第80-81页 |
| ·比生长速率μ的优化 | 第81页 |
| ·溶氧反馈-分批补料高密度发酵 | 第81页 |
| ·三种流加方式比较 | 第81页 |
| ·结果与讨论 | 第81-90页 |
| ·发酵培养基的筛选 | 第81-82页 |
| ·培养基pH值对工程菌生长和PED-N表达的影响 | 第82-83页 |
| ·甘油浓度对工程菌生长和PED-N表达的影响 | 第83页 |
| ·蛋白胨浓度对工程菌生长和PED-N表达的影响 | 第83-84页 |
| ·最佳乳糖浓度的确定 | 第84-85页 |
| ·诱导温度对PED-N表达的影响 | 第85-86页 |
| ·乳糖最佳诱导时间的确定 | 第86页 |
| ·诱导剂加入方式 | 第86-87页 |
| ·高密度发酵最佳溶氧浓度 | 第87页 |
| ·比生长速率μ的优化 | 第87-88页 |
| ·E.coli BL21/pET32c-PED工程菌的高密度发酵 | 第88-89页 |
| ·流加方式对高密度发酵的影响 | 第89页 |
| ·工程菌稳定性检测 | 第89-90页 |
| ·小结 | 第90-92页 |
| 第六章 多阶段碳氮比流加策略对重组大肠杆菌生长和融合型乳酸片球菌素表达的影响 | 第92-101页 |
| ·引言 | 第92页 |
| ·材料与方法 | 第92-95页 |
| ·仪器、试剂与菌株 | 第92页 |
| ·主要仪器 | 第92页 |
| ·试剂 | 第92页 |
| ·菌株 | 第92页 |
| ·分析方法 | 第92-93页 |
| ·菌浓的测定 | 第92-93页 |
| ·取样方法 | 第93页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第93页 |
| ·Tris-SDS-PAGE电泳 | 第93页 |
| ·摇瓶实验碳氮比对重组E.coli生长的影响 | 第93页 |
| ·碳氮比对可溶性PED-N和PED-N包涵体表达的影响 | 第93页 |
| ·培养方法与补料流加策略 | 第93-94页 |
| ·培养基 | 第93页 |
| ·补料流加策略 | 第93-94页 |
| ·碳氮平衡流加对重组E.coli生长的影响 | 第94页 |
| ·碳氮平衡流加对PED-N表达的影响 | 第94页 |
| ·碳氮平衡流加对残糖与乙酸积累的影响 | 第94-95页 |
| ·葡萄糖残糖浓度的测定 | 第94页 |
| ·乙酸积累量的测定 | 第94-95页 |
| ·结果与讨论 | 第95-100页 |
| ·摇瓶实验碳氮比对重组E.coli生长的影响 | 第95页 |
| ·碳氮比对PED-N表达的影响(摇瓶) | 第95-97页 |
| ·碳氮平衡流加过程中的多阶段碳氮比 | 第97页 |
| ·碳氮平衡流加对重组E.coli生长的影响 | 第97-98页 |
| ·碳氮平衡流加对PED-N表达的影响 | 第98-99页 |
| ·碳氮平衡流加对残糖与乙酸积累的影响 | 第99-100页 |
| ·小结 | 第100-101页 |
| 第七章 结论与展望 | 第101-104页 |
| ·结论 | 第101-103页 |
| ·展望 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第118页 |
