| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-23页 |
| 1.1 富马酸概述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 石化途径生产富马酸 | 第12-13页 |
| 1.1.2 酶催化苹果酸转化成富马酸 | 第13页 |
| 1.1.3 微生物发酵法生产富马酸 | 第13-14页 |
| 1.2 光滑球拟酵母是有机酸生产的细胞工厂 | 第14-16页 |
| 1.2.1 光滑球拟酵母GSMM的构建与分析 | 第15页 |
| 1.2.2 光滑球拟酵母代谢途径的设计和改造 | 第15-16页 |
| 1.2.3 光滑球拟酵母代谢途径和代谢流的优化 | 第16页 |
| 1.3 代谢工程在工业生物技术领域中的应用 | 第16-20页 |
| 1.3.1 启动子工程 | 第17-18页 |
| 1.3.2 基因组工程 | 第18页 |
| 1.3.3 蛋白质工程 | 第18-19页 |
| 1.3.4 结构合成生物学 | 第19页 |
| 1.3.5 系统代谢工程 | 第19-20页 |
| 1.3.6 辅因子工程 | 第20页 |
| 1.4 本论文主要研究内容 | 第20-23页 |
| 1.4.1 代谢工程改造T. glabrata生产富马酸面临的科学问题 | 第20-21页 |
| 1.4.2 本论文主要研究内容 | 第21-23页 |
| 第二章 重构胞质TCA还原路径生产富马酸前体苹果酸 | 第23-34页 |
| 2.1 前言 | 第23-24页 |
| 2.2 材料与方法 | 第24-27页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第24页 |
| 2.2.2 苹果酸生物合成基因的分离 | 第24页 |
| 2.2.3 质粒构建与转化 | 第24-26页 |
| 2.2.4 培养基 | 第26页 |
| 2.2.5 培养条件 | 第26页 |
| 2.2.6 分析方法 | 第26页 |
| 2.2.7 全基因组规模代谢网络模型预测分析菌体表型 | 第26-27页 |
| 2.2.8 基因转录水平分析 | 第27页 |
| 2.2.9 胞内代谢物的提取 | 第27页 |
| 2.2.10 酶活测定 | 第27页 |
| 2.3 结果 | 第27-31页 |
| 2.3.1 过量表达丙酮酸羧化酶对碳流分配的影响 | 第27-29页 |
| 2.3.2 过量表达苹果酸脱氢酶对苹果酸生产的影响 | 第29页 |
| 2.3.3 苹果酸生产的瓶颈分析 | 第29-31页 |
| 2.3.4 过量表达苹果酸转运子对苹果酸生产的影响 | 第31页 |
| 2.4 讨论 | 第31-33页 |
| 2.5 本章小结 | 第33-34页 |
| 第三章 定向改造富马酸酶生产富马酸 | 第34-44页 |
| 3.1 前言 | 第34-35页 |
| 3.2 材料与方法 | 第35-37页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第35页 |
| 3.2.2 培养基和培养条件 | 第35页 |
| 3.2.3 定点突变 | 第35-36页 |
| 3.2.4 富马酸酶纯化 | 第36页 |
| 3.2.5 富马酸酶酶活测定 | 第36页 |
| 3.2.6 分子对接 | 第36页 |
| 3.2.7 pH和温度对富马酸酶活性的影响 | 第36页 |
| 3.2.8 点突变对富马酸酶动力学参数的影响 | 第36页 |
| 3.2.9 富马酸酶突变体对富马酸生产的影响 | 第36-37页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第37-43页 |
| 3.3.1 借助分子对接方法筛选突变位点 | 第37-38页 |
| 3.3.2 pH和温度对富马酸酶活性的影响 | 第38-40页 |
| 3.3.3 点突变对富马酸酶动力学参数的影响 | 第40-42页 |
| 3.3.4 突变体对富马酸生产的影响 | 第42-43页 |
| 3.4 本章小结 | 第43-44页 |
| 第四章 重构线粒体TCA氧化路径生产富马酸 | 第44-59页 |
| 4.1 前言 | 第44-45页 |
| 4.2 材料与方法 | 第45-49页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第45页 |
| 4.2.2 富马酸生物合成基因的分离 | 第45-46页 |
| 4.2.3 质粒构建与转化 | 第46-48页 |
| 4.2.4 培养基 | 第48页 |
| 4.2.5 培养条件 | 第48-49页 |
| 4.2.6 分析方法 | 第49页 |
| 4.2.7 Western blot分析 | 第49页 |
| 4.2.8 GFP表达分析 | 第49页 |
| 4.2.9 酶活测定 | 第49页 |
| 4.2.10 基因转录水平分析 | 第49页 |
| 4.2.11 胞内代谢物的提取 | 第49页 |
| 4.3 结果 | 第49-56页 |
| 4.3.1 构建富马酸生产的氧化路径 | 第49-51页 |
| 4.3.2 路径优化提高富马酸的产量 | 第51-53页 |
| 4.3.3 改造关键代谢节点进一步提高富马酸产量 | 第53-55页 |
| 4.3.4 利用转运子工程改善富马酸产量 | 第55-56页 |
| 4.4 讨论 | 第56-58页 |
| 4.5 本章小结 | 第58-59页 |
| 第五章 重构尿素循环和嘌呤核苷酸循环生产富马酸 | 第59-73页 |
| 5.1 前言 | 第59-60页 |
| 5.2 材料与方法 | 第60-64页 |
| 5.2.1 菌株与质粒 | 第60页 |
| 5.2.2 富马酸生物合成基因的分离 | 第60页 |
| 5.2.3 质粒构建与转化 | 第60-63页 |
| 5.2.4 培养基 | 第63页 |
| 5.2.5 培养条件 | 第63页 |
| 5.2.6 分析方法 | 第63页 |
| 5.2.7 GFP表达分析 | 第63页 |
| 5.2.8 用于模拟预测菌体表型与代谢路径的计算程序 | 第63页 |
| 5.2.9 胞内代谢物测定 | 第63页 |
| 5.2.10 酶活测定 | 第63-64页 |
| 5.3 结果 | 第64-70页 |
| 5.3.1 富马酸代谢路径 | 第64-66页 |
| 5.3.2 单基因过量表达对富马酸生产的影响 | 第66-67页 |
| 5.3.3 ASL和ADSL过量表达对富马酸生产的影响 | 第67-69页 |
| 5.3.4 过量表达二羧酸转运子对富马酸生产的影响 | 第69-70页 |
| 5.4 讨论 | 第70-72页 |
| 5.5 本章小结 | 第72-73页 |
| 第六章 模块路径工程优化多基因合成路径生产富马酸 | 第73-90页 |
| 6.1 前言 | 第73-74页 |
| 6.2 材料与方法 | 第74-78页 |
| 6.2.1 菌种和质粒 | 第74-78页 |
| 6.2.2 质粒构建与转化 | 第78页 |
| 6.2.3 培养条件 | 第78页 |
| 6.2.4 代谢物分析 | 第78页 |
| 6.2.5 基因转录水平分析 | 第78页 |
| 6.3 结果 | 第78-88页 |
| 6.3.1 富马酸合成路径模块化分析 | 第78-79页 |
| 6.3.2 富马酸酶改造 | 第79-81页 |
| 6.3.3 路径优化提高富马酸产量 | 第81-82页 |
| 6.3.4 优化基因表达强度精细化控制富马酸合成 | 第82-85页 |
| 6.3.5 空间控制路径关键酶增强富马酸生产 | 第85-86页 |
| 6.3.6 合成sRNA开关拓展富马酸合成 | 第86-88页 |
| 6.4 讨论 | 第88-89页 |
| 6.5 本章小结 | 第89-90页 |
| 主要结论与展望 | 第90-92页 |
| 主要结论 | 第90-91页 |
| 展望 | 第91-92页 |
| 论文创新点 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-106页 |
| 附录I：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第106页 |
