| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-20页 |
| ·微生物发酵生产天然γ-癸内酯的机理 | 第11-12页 |
| ·对发酵生产γ-癸内酯的Yarrowia lipolytica 进行的基础性研究 | 第12-13页 |
| ·Yarrowia lipolytica 产γ-癸内酯的相关基因的功能研究 | 第13-15页 |
| ·国外进行相关基因研究所采用的技术与方法 | 第15-17页 |
| ·本实验所采取的基因敲除和自克隆技术 | 第17-18页 |
| ·本论文的工作意义及主要内容 | 第18-20页 |
| 第二章 Yarrowia lipolytica 酵母AS 2.1405 URA3 基因的敲除及产γ-癸内酯培养条件的优化 | 第20-56页 |
| ·材料 | 第20-27页 |
| ·菌株和质粒 | 第20页 |
| ·工具酶 | 第20-21页 |
| ·引物设计 | 第21页 |
| ·主要试剂 | 第21-24页 |
| ·培养基 | 第24-25页 |
| ·主要实验仪器 | 第25-27页 |
| ·实验方法流程 | 第27-40页 |
| ·菌种活化 | 第28页 |
| ·液体种子培养 | 第28-29页 |
| ·酵母基因组DNA 提取 | 第29页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第29-30页 |
| ·DNA 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第30-31页 |
| ·目的片段DNA 的回收 | 第31-32页 |
| ·回收片段的检测 | 第32页 |
| ·感受态大肠杆菌制备和转化 | 第32-33页 |
| ·质粒M13 的大量提取 | 第33页 |
| ·M13 质粒和URA3 基因的酶切 | 第33-34页 |
| ·酶连及重组质粒M13-URA3 的构建 | 第34-35页 |
| ·重组质粒M13-URA3 的转化和筛选 | 第35页 |
| ·重组质粒M13-URA3 快速抽提 | 第35页 |
| ·重组质粒的提取 | 第35页 |
| ·重组质粒M13-URA3 的鉴定 | 第35-36页 |
| ·URA3 基因敲除质粒的构建 | 第36-37页 |
| ·URA3 基因敲除质粒的酶切和PCR 扩增鉴定 | 第37页 |
| ·将URA3 基因敲除组件转化酵母 | 第37-38页 |
| ·尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建及筛选 | 第38页 |
| ·尿嘧啶营养缺陷型菌株的分子生物学验证 | 第38页 |
| ·尿嘧啶营养缺陷型菌株初步摇瓶发酵 | 第38-39页 |
| ·γ-癸内酯粗样的制备 | 第39页 |
| ·γ-癸内酯的气相色谱检测 | 第39页 |
| ·γ-癸内酯标准曲线的绘制以及含量测定 | 第39页 |
| ·确定最佳的尿嘧啶添加浓度 | 第39-40页 |
| ·实验结果与分析 | 第40-54页 |
| ·酵母基因组DNA 提取 | 第40页 |
| ·目的基因URA3 基因的PCR 扩增 | 第40-41页 |
| ·PCR 产物切胶回收 | 第41-42页 |
| ·原始质粒M13 提取 | 第42页 |
| ·酶连及重组质粒构建 | 第42-45页 |
| ·构建URA3 基因敲除组件 | 第45-46页 |
| ·利用基因敲除组件转化酵母 | 第46-47页 |
| ·URA3 基因敲除和营养缺陷型菌株的初步筛选 | 第47-49页 |
| ·营养缺陷型菌株的进一步筛选鉴定 | 第49-50页 |
| ·尿嘧啶营养缺陷型菌株的培养基验证和分子生物学鉴定 | 第50-51页 |
| ·γ-癸内酯检测方法的确定及标准曲线的绘制 | 第51-52页 |
| ·原始菌株和缺陷型菌株γ-癸内酯生产曲线的绘制 | 第52页 |
| ·不同浓度梯度尿嘧啶发酵培养基产γ-癸内酯的量 | 第52-53页 |
| ·营养缺陷型菌株和野生型菌株产γ-癸内酯量的分析 | 第53-54页 |
| ·本章小结 | 第54-56页 |
| 第三章 敲除解脂耶氏酵母POX3 基因提高γ-癸内酯产量 | 第56-74页 |
| ·材料与方法 | 第56-58页 |
| ·菌株与质粒 | 第56页 |
| ·酶与主要试剂溶液 | 第56-57页 |
| ·引物设计 | 第57页 |
| ·培养基 | 第57页 |
| ·主要实验仪器 | 第57-58页 |
| ·实验方法 | 第58-65页 |
| ·铜离子对该酵母最低杀伤浓度的确定 | 第58页 |
| ·POX3 基因和铜抗性CRF1 基因的PCR 扩增 | 第58-59页 |
| ·pMX3 质粒载体的构建 | 第59-61页 |
| ·POX3 基因敲除组件pMPC1 的构建 | 第61-63页 |
| ·POX3 基因的敲除和筛选 | 第63-64页 |
| ·POX3 基因敲除后转化子的摇瓶发酵和γ-癸内酯粗提取 | 第64页 |
| ·γ-癸内酯的气相色谱检测 | 第64页 |
| ·γ-癸内酯的标准曲线 | 第64-65页 |
| ·结果与讨论 | 第65-70页 |
| ·POX3 基因和CRF1 基因的PCR 扩增 | 第65页 |
| ·基因敲除组件的构建过程 | 第65-66页 |
| ·pMX3 质粒的快抽质粒的酶切鉴定 | 第66页 |
| ·POX3 基因敲除组件pMPC1 的酶切和PCR 鉴定 | 第66-68页 |
| ·转化子和野生型的铜抗性比较 | 第68-69页 |
| ·转化子TA1 的分子生物学鉴定 | 第69页 |
| ·POX3 基因敲除后转化子的摇瓶发酵和γ-癸内酯粗含量检测 | 第69-70页 |
| ·讨论 | 第70-72页 |
| ·目的片段DNA 回收率的影响 | 第70-71页 |
| ·酶切实验中的影响因素 | 第71页 |
| ·关于转化率的个人经验总结 | 第71-72页 |
| ·本章小结 | 第72-74页 |
| 第四章 POX3 基因敲除菌株TA1 发酵条件的优化 | 第74-88页 |
| ·材料与方法 | 第74-78页 |
| ·实验菌株 | 第74页 |
| ·主要实验仪器 | 第74-75页 |
| ·主要实验试剂 | 第75页 |
| ·培养基 | 第75-76页 |
| ·γ-癸内酯分析方法 | 第76页 |
| ·最适碳源的确定 | 第76页 |
| ·最佳氮源的确定 | 第76页 |
| ·最佳发酵温度的确定 | 第76页 |
| ·最佳pH 值的确定 | 第76-77页 |
| ·最适接种量的确定 | 第77页 |
| ·最佳装液量的确定 | 第77页 |
| ·进一步正交优化发酵培养基 | 第77页 |
| ·对发酵最佳条件进行验证 | 第77页 |
| ·转化子TA1 菌株在最有条件下发酵产γ-癸内酯量的过程 | 第77-78页 |
| ·结果与分析讨论 | 第78-86页 |
| ·最佳碳源的确定 | 第78-79页 |
| ·最佳氮源的确定 | 第79页 |
| ·最佳温度的确定 | 第79-80页 |
| ·最佳pH 值的确定 | 第80-81页 |
| ·接种量对发酵的影响 | 第81-82页 |
| ·装液量对发酵的影响 | 第82-83页 |
| ·正交实验确定最佳发酵条件 | 第83-85页 |
| ·最佳发酵条件的验证 | 第85页 |
| ·转化子TA1 和营养缺陷型发酵γ-癸内酯的过程比对 | 第85-86页 |
| ·转化子TA1 遗传稳定性的考察 | 第86页 |
| ·本章小结 | 第86-88页 |
| 第五章 结论与展望 | 第88-90页 |
| ·结论 | 第88-89页 |
| ·展望 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-94页 |
| 附录A | 第94-95页 |
| 附录B | 第95-96页 |
| 附录C | 第96-97页 |
| 附录D | 第97-99页 |
| 附录E | 第99页 |
| 附录F | 第99-100页 |
| 在学期间发表的论文及科研成果清单 | 第100-101页 |
| 致谢 | 第101页 |
