| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 引言 | 第11-23页 |
| 1.1 立题背景及目的 | 第11页 |
| 1.2 蜡样芽孢杆菌的简介 | 第11-13页 |
| 1.2.1 蜡样芽孢杆菌的生物学性状 | 第11-12页 |
| 1.2.2 蜡样芽孢杆菌的临床症状与致病性 | 第12-13页 |
| 1.2.3 蜡样芽孢杆菌的流行病情况 | 第13页 |
| 1.3 食品中蜡样芽孢杆菌常见的检测方法 | 第13-15页 |
| 1.3.1 传统检测方法 | 第13-14页 |
| 1.3.2 蜡样芽孢杆菌快速检测方法 | 第14-15页 |
| 1.4 环介导等温扩增(LAMP)技术 | 第15-20页 |
| 1.4.1 LAMP的引物设计[43] | 第16-17页 |
| 1.4.2 LAMP的扩增原理 | 第17-19页 |
| 1.4.3 反应体系及条件 | 第19页 |
| 1.4.4 LAMP反应的结果观察 | 第19-20页 |
| 1.5 实时荧光环介导等温扩增技术（RealAmp） | 第20-22页 |
| 1.5.1 检测设备 | 第20-21页 |
| 1.5.2 RealAmp的特点 | 第21页 |
| 1.5.3 RealAmp反应的注意事项 | 第21-22页 |
| 1.6 本课题主要研究内容 | 第22-23页 |
| 2 材料和方法 | 第23-32页 |
| 2.1 材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 菌株 | 第23-24页 |
| 2.1.2 仪器设备 | 第24页 |
| 2.1.3 试验用培养基 | 第24页 |
| 2.1.4 样品与生化试剂 | 第24-25页 |
| 2.2 细菌基因组DNA的提取方法 | 第25页 |
| 2.2.1 蜡样芽孢杆菌菌种培养 | 第25页 |
| 2.2.2 蜡样芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第25页 |
| 2.3 引物设计和操作步骤 | 第25-27页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第25-26页 |
| 2.3.2 引物的处理 | 第26页 |
| 2.3.3 RealAmp主要操作程序 | 第26-27页 |
| 2.4 RealAmp反应条件优化 | 第27-28页 |
| 2.4.110×BstDNA聚合酶缓冲液（Buffer）的优化 | 第27页 |
| 2.4.2 dNTPs优化 | 第27页 |
| 2.4.3 Mg2+优化 | 第27页 |
| 2.4.4 甜菜碱添加量的优化 | 第27页 |
| 2.4.5 DNA模板添加量的优化 | 第27-28页 |
| 2.4.6 BstDNA聚合酶的优化 | 第28页 |
| 2.4.7 引物对RealAmp反应的影响 | 第28页 |
| 2.4.8 温度试验 | 第28页 |
| 2.5 特异性试验 | 第28-29页 |
| 2.5.1 特异性试验 | 第28-29页 |
| 2.5.2 引物PCR特异性的检测 | 第29页 |
| 2.6 验证RealAmp反应检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度 | 第29页 |
| 2.6.1 RealAmp检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度 | 第29页 |
| 2.6.2 普通LAMP检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度 | 第29页 |
| 2.7 判断RealAmp反应是否扩增的方法 | 第29-30页 |
| 2.7.1 RealAmp反应实时荧光监测仪图谱分析 | 第29-30页 |
| 2.7.2 电泳分析 | 第30页 |
| 2.7.3 RealAmp反应结果酶切分析 | 第30页 |
| 2.7.4 沉淀观察法 | 第30页 |
| 2.8 人工污染牛奶RealAmp的检出限 | 第30-32页 |
| 2.8.1 人工污染牛奶 | 第30-31页 |
| 2.8.2RealAmp检测人工污染牛奶中蜡样芽孢杆菌的检出限 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-49页 |
| 3.1 RealAmp反应条件的优化 | 第32-39页 |
| 3.1.1 10×BstDNA聚合酶缓冲液（Buffer）优化试验 | 第32页 |
| 3.1.2 dNTPs优化 | 第32-33页 |
| 3.1.3 Mg2+优化试验 | 第33-34页 |
| 3.1.4 甜菜碱添加量的优化 | 第34页 |
| 3.1.5 模板DNA添加量的优化 | 第34-35页 |
| 3.1.6 Bst DNA酶添加量的优化 | 第35-36页 |
| 3.1.7 引物对RealAmp反应的影响 | 第36-37页 |
| 3.1.8 反应温度优化 | 第37-39页 |
| 3.1.9 RealAmp反应的最佳反应体系 | 第39页 |
| 3.2 引物特异性的研究 | 第39-42页 |
| 3.2.1 RealAmp引物特异性的检测 | 第39-41页 |
| 3.2.2 引物PCR特异性的检测 | 第41-42页 |
| 3.3 RealAmp检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度 | 第42-44页 |
| 3.3.1 测定被检蜡样芽孢杆菌的浓度 | 第42页 |
| 3.3.2 RealAmp检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度 | 第42-43页 |
| 3.3.3 普通LAMP检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度 | 第43-44页 |
| 3.4 判断RealAmp是否扩增的方法 | 第44-47页 |
| 3.4.1 RealAmp图谱分析 | 第44-45页 |
| 3.4.2 RealAmp反应凝胶成像分析 | 第45-46页 |
| 3.4.3 LAMP结果酶切分析 | 第46页 |
| 3.4.4 沉淀观察法 | 第46-47页 |
| 3.5 人工污染牛奶RealAmp的检出限 | 第47-49页 |
| 4 讨论 | 第49-53页 |
| 4.1 方法学评价 | 第49页 |
| 4.2 实时荧光环介导等温扩增技术(RealAmp)靶基因的选择 | 第49-50页 |
| 4.3 实时荧光环介导等温扩增技术(RealAmp)引物的选择 | 第50页 |
| 4.4 体系中各成分的优化 | 第50-51页 |
| 4.5 实时荧光环介导等温扩增技术(RealAmp)的特异性 | 第51页 |
| 4.6 实时荧光环介导等温扩增技术(RealAmp)与普通LAMP灵敏度的比较 | 第51页 |
| 4.7 实时荧光环介导等温扩增技术(RealAmp)检测牛奶中蜡样芽孢杆菌的检出限 | 第51-52页 |
| 4.8 实时荧光环介导等温扩增技术(RealAmp)防污染控制 | 第52-53页 |
| 5 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 硕士期间发表学术论文 | 第59-60页 |
| 作者简介 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
