| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 1 引言 | 第14-30页 |
| 1.1 miRNA 的研究进展 | 第14-19页 |
| 1.1.1 miRNA 的发现 | 第14-15页 |
| 1.1.2 动植物体内 miRNA 的合成 | 第15-16页 |
| 1.1.2.1 动物体内 miRNA 的合成 | 第15页 |
| 1.1.2.2 植物体内 miRNA 的合成 | 第15-16页 |
| 1.1.3 miRNA 在生物体内功能研究 | 第16-19页 |
| 1.1.3.1 miRNA 调控基因表达 | 第17页 |
| 1.1.3.2 miRNA 与疾病 | 第17-19页 |
| 1.2 miRNA 定量方法研究进展 | 第19-24页 |
| 1.2.1 基于杂交技术的检测方法 | 第19页 |
| 1.2.1.1 RNA 印迹法（Northern blotting） | 第19页 |
| 1.2.1.2 基因芯片 | 第19页 |
| 1.2.2 基于分子扩增的检测方法 | 第19-24页 |
| 1.2.2.1 实时定量 PCR | 第19-23页 |
| 1.2.2.2 滚环扩增法（Rolling-circle amplification, RCA） | 第23页 |
| 1.2.2.3 高通量测序 | 第23-24页 |
| 1.3 miRNA 生产及分离纯化技术研究进展 | 第24-25页 |
| 1.4 分级醇沉法在物质分离纯化中的应用 | 第25-26页 |
| 1.5 牙鲆鱼与 miR-206 | 第26-28页 |
| 1.6 本研究的目的意义及主要内容 | 第28-30页 |
| 1.6.1 miRNA 的跨“界”调控作用与获取大量可食用 miRNA 技术的开发 | 第28-29页 |
| 1.6.2 本研究的技术路线与主要内容 | 第29-30页 |
| 2 基于茎环引物 RT-qPCR 定量检测 miRNA 方法的建立及牙鲆鱼样品中 miR-206 的含量测定 | 第30-44页 |
| 2.1 引言 | 第30-31页 |
| 2.2 实验材料 | 第31-33页 |
| 2.2.1 动物材料及耗材 | 第31-32页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第32页 |
| 2.2.3 实验试剂 | 第32页 |
| 2.2.4 所用 miRNA 及引物序列 | 第32-33页 |
| 2.3 实验方法 | 第33-37页 |
| 2.3.1 利用茎环引物逆转录 miRNA 标准品 | 第33-34页 |
| 2.3.2 逆转录产物 cDNA 的普通 PCR 扩增及产物电泳分析 | 第34-35页 |
| 2.3.3 实时荧光定量 PCR 扩增 cDNA | 第35页 |
| 2.3.4 牙鲆鱼鱼肉骨骼肌与鱼糜水 miRNA 含量的定性与定量检测 | 第35-37页 |
| 2.3.4.1 miRNA 的提取 | 第35-36页 |
| 2.3.4.2 样品提取产物中 miRNA 的定量检测 | 第36页 |
| 2.3.4.3 样品提取产物中 miRNA 的定性检测 | 第36-37页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第37-43页 |
| 2.4.1 茎环引物普通 PCR 扩增检测 miRNA | 第37-38页 |
| 2.4.2 PCR 过程中反应循环数量对非特异性扩增的影响 | 第38-39页 |
| 2.4.3 茎环引物法定量检测 miR-206 与 miR-168a 标准曲线的建立 | 第39-41页 |
| 2.4.4 牙鲆鱼与黑鱼骨骼肌小 RNA 的定性检测 | 第41-42页 |
| 2.4.5 牙鲆鱼与黑鱼骨骼肌小 RNA 的定量检测 | 第42-43页 |
| 2.5 本章小结 | 第43-44页 |
| 3 乙醇沉淀法富集牙鲆鱼骨骼肌中 miRNA 的研究初探 | 第44-56页 |
| 3.1 引言 | 第44-45页 |
| 3.2 实验材料 | 第45-46页 |
| 3.2.1 动物材料及试剂 | 第45页 |
| 3.2.2 实验使用仪器 | 第45-46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-48页 |
| 3.3.1 富集样品的预处理与细胞破碎 | 第46页 |
| 3.3.1.1 实验耗材及用具去 RNA 酶处理 | 第46页 |
| 3.3.1.2 牙鲆鱼骨骼肌的预处理 | 第46页 |
| 3.3.1.3 超声震荡和冻融处理破裂细胞 | 第46页 |
| 3.3.2 miRNA 在不同浓度乙醇中的沉淀 | 第46-47页 |
| 3.3.3 不同浓度乙醇富集 miRNA | 第47页 |
| 3.3.4 梯度醇沉富集 miRNA | 第47-48页 |
| 3.3.5 样品处理后电泳定性检测与 miR-206 的定量检测 | 第48页 |
| 3.3.5.1 样品检测前预处理 | 第48页 |
| 3.3.5.2 电泳定性检测样品中核酸 | 第48页 |
| 3.3.5.3 实时荧光定量 PCR 定量检测 miR-206 | 第48页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第48-54页 |
| 3.4.1 不同处理方式对上清液中 miRNA 含量的影响 | 第48-50页 |
| 3.4.2 不同乙醇浓度富集 miRNA | 第50-51页 |
| 3.4.3 MiRNA 在不同浓度乙醇中的沉淀 | 第51-52页 |
| 3.4.4 梯度醇沉富集 miRNA | 第52-54页 |
| 3.5 本章小结 | 第54-56页 |
| 4 胶膜电泳法富集 miRNA | 第56-74页 |
| 4.1 引言 | 第56-57页 |
| 4.2 实验试剂及仪器 | 第57-58页 |
| 4.2.1 实验试剂 | 第57-58页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第58页 |
| 4.3 实验方法 | 第58-63页 |
| 4.3.1 实验前期准备 | 第58-60页 |
| 4.3.1.1 实验耗材去 RNA 酶处理 | 第58-59页 |
| 4.3.1.2 电泳缓冲液及琼脂糖凝胶的配制 | 第59页 |
| 4.3.1.3 82 bp DNA 片段的大量制备 | 第59-60页 |
| 4.3.2 胶膜电泳富集 DNA | 第60-61页 |
| 4.3.2.1 电泳时间对分离效果的影响 | 第60页 |
| 4.3.2.2 电压（电场强度）对分离效果的影响 | 第60页 |
| 4.3.2.3 缓冲液浓度（即离子强度）对分离效果的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.2.4 不同电泳条件下缓冲液温度变化 | 第61页 |
| 4.3.2.5 琼脂糖凝胶膜浓度对分离效果的影响 | 第61页 |
| 4.3.3 胶膜电泳分离样品中 DNA 或 miRNA | 第61页 |
| 4.3.3.1 胶膜电泳法富集 282 bp DNA | 第61页 |
| 4.3.3.2 胶膜电泳富集鱼糜水上清核酸并对醇沉 miRNA 样品进行纯化 | 第61页 |
| 4.3.4 电泳定性分析胶膜电泳富集效果 | 第61-62页 |
| 4.3.5 荧光定量 PCR 定量检测胶膜电泳产物特定核酸浓度 | 第62页 |
| 4.3.6 紫外分光光度计分析产品纯度 | 第62-63页 |
| 4.3.7 实时荧光定量 PCR 定量检测 miR-206 | 第63页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第63-72页 |
| 4.4.1 实时荧光定量 PCR 定量检测 82 bp DNA 标准曲线的建立 | 第63-64页 |
| 4.4.2 电压对胶膜电泳富集核酸效果的影响 | 第64-65页 |
| 4.4.3 离子强度对胶膜电泳富集核酸效果的影响 | 第65-67页 |
| 4.4.4 胶膜浓度对胶膜电泳富集核酸效果的影响 | 第67-68页 |
| 4.4.5 胶膜电泳富集 282 bp DNA | 第68-69页 |
| 4.4.6 胶膜电泳富集鱼糜水上清中核酸 | 第69-71页 |
| 4.4.7 胶膜电泳富集并纯化分级醇沉样品 | 第71-72页 |
| 4.5 本章小结 | 第72-74页 |
| 5 结论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 附录 | 第81-83页 |
| 1 茎环引物法定量 miR-206 原理示意图 | 第81页 |
| 2 胶膜电泳实验装置实物图 | 第81-82页 |
| 3 英文缩写词表 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 个人简历 | 第84页 |
| 研究生期间发表的研究成果 | 第84-85页 |
