| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 缩写符号 | 第18-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-36页 |
| 1 Surfactin的结构和功能 | 第19-20页 |
| 2 Surfactin合成酶的结构和功能 | 第20-21页 |
| 3 新型Surfactin衍生物的探索-组合生物学 | 第21-26页 |
| 3.1 对非核糖体合成酶进行定点突变产生新型抗菌脂肽 | 第22-23页 |
| 3.2 对非核糖体合成酶进行模块替换产生新型抗菌脂肽 | 第23-25页 |
| 3.3 对非核糖体合成酶进行模块删除产生新型抗菌脂肽 | 第25-26页 |
| 4 枯草芽孢杆菌基因工程-基因敲除方法 | 第26-30页 |
| 4.1 基本概况 | 第26-27页 |
| 4.2 同源重组 | 第27-28页 |
| 4.2.1 利用基因同源重组进行基因敲除 | 第27页 |
| 4.2.2 利用基因同源重组技术对目的基因进行敲除的方法步骤 | 第27-28页 |
| 4.3 插入突变 | 第28-29页 |
| 4.4 RNA干扰 | 第29-30页 |
| 4.4.1 RNA干扰阻断基因表达的原理 | 第29页 |
| 4.4.2 RNA干扰基因敲除的优点 | 第29-30页 |
| 5 抗菌脂肽对真菌抑菌机理研究进展 | 第30-32页 |
| 5.1 对细菌的抑菌机理 | 第30页 |
| 5.1.1 对细胞膜的抑制作用 | 第30页 |
| 5.1.2 对细胞壁的抑制作用 | 第30页 |
| 5.2 对真菌的抑菌机理 | 第30-31页 |
| 5.2.1 对真菌菌丝的影响 | 第30-31页 |
| 5.2.2 对真菌细胞壁的影响 | 第31页 |
| 5.3 抗菌脂肽对细胞凋亡的影响 | 第31-32页 |
| 6 利用iTRAQ技术在蛋白质组学中的应用 | 第32-34页 |
| 6.1 iTRAQ技术的背景 | 第32-33页 |
| 6.2 iTRAQ技术的原理 | 第33页 |
| 6.3 iTRAQ技术与传统2D电泳技术的比较 | 第33-34页 |
| 6.4 iTRAQ技术在微生物中的应用 | 第34页 |
| 7 研究意义、内容及技术路线 | 第34-36页 |
| 技术路线 | 第36-37页 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌产新型Surfactin衍生物敲除菌株的构建 | 第37-59页 |
| 1 材料与方法 | 第37-43页 |
| 1.1 材料 | 第37-40页 |
| 1.1.1 菌株、质粒 | 第37-38页 |
| 1.1.2 主要试剂和仪器 | 第38页 |
| 1.1.3 培养基及培养条件 | 第38页 |
| 1.1.4 引物 | 第38-40页 |
| 1.2 方法 | 第40-43页 |
| 1.2.1 枯草168菌株总DNA的提取 | 第40页 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 | 第40-41页 |
| 1.2.3 pMD-19T-△Leu重组质粒的构建 | 第41页 |
| 1.2.4 pKS2重组载体的构建 | 第41-42页 |
| 1.2.5 温敏型质粒pKS2重组载体的制备 | 第42页 |
| 1.2.6 对枯草168进行感受态制备与转化 | 第42-43页 |
| 1.2.7 pKS2质粒诱导敲除方法 | 第43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-56页 |
| 2.1 枯草芽孢杆菌LS1构建结果 | 第43-47页 |
| 2.1.1 对B.subtilis PB2-1中SurfactinA亚基D-Leu模块删除上下游序列进行扩增 | 第43页 |
| 2.1.2 对B.subtilis PB2-1中SurfactinA亚基D-Leu模块删除上下游序列进行重叠PCR连接 | 第43-44页 |
| 2.1.3 对SurfactinA亚基D-Leu模块上下游序列连接产物进行T载体连接 | 第44-45页 |
| 2.1.4 对B.subtilis PB2-1中SurfactinA亚基D-Leu模块删除上下游序列测序结果 | 第45页 |
| 2.1.5 重组pKS2载体pKS2-srfA-C-△Leu进行双酶切验证 | 第45-46页 |
| 2.1.6 对B.subtilis PB2-1进行pKS2-srfA-C-△Leu重组载体诱导敲除 | 第46页 |
| 2.1.7 筛选Kan平板上单菌落进行点板验证 | 第46-47页 |
| 2.1.8 对B.subtilis PB2-1删除SurfactinA亚基D-Leu模块菌株进行验证 | 第47页 |
| 2.2 枯草芽孢杆菌LS6构建结果 | 第47-51页 |
| 2.2.1 对B.subtilis PB2-L1中SurfactinB亚基L-Asp模块删除上下游序列进行扩增 | 第47-48页 |
| 2.2.2 对B.subtilis PB2-L1中SurfactinB亚基L-Asp模块删除上下游序列进行重叠PCR连接 | 第48-49页 |
| 2.2.3 对SurfactinB亚基L-Asp模块上下游序列连接产物进行T载体连接 | 第49-50页 |
| 2.2.4 对B.subtilis PB2-L1中SurfactinB亚基L-Asp模块删除上下游序列测序结果 | 第50页 |
| 2.2.5 对重组pKS2载体pKS2-srfB-B-△Asp进行双酶切验证 | 第50页 |
| 2.2.6 对B.subtilis PB2-1进行pKS2-srfB-B-△Asp重组载体诱导敲除 | 第50页 |
| 2.2.7 筛选Kan平板对应的单菌落进行点板验证 | 第50-51页 |
| 2.2.8 对B.subtilis PB2-L1删除SurfactinB亚基L-Asp模块菌株进行验证 | 第51页 |
| 2.3 枯草芽孢杆菌LS9构建结果 | 第51-56页 |
| 2.3.1 对B.subtilis PB2-L1中SurfactinB亚基D-Leu模块删除上下游序列进行扩增 | 第51-52页 |
| 2.3.2 对B.subtilis PB2-L1中SurfactinB亚基D-Leu模块删除上下游序列进行重叠PCR连接 | 第52-53页 |
| 2.3.3 对SurfactinB亚基D-Leu模块上下游序列进行T载体连接 | 第53-54页 |
| 2.3.4 对B.subtilis PB2-L1中SurfactinB亚基D-Leu模块删除上下游序列测序结果 | 第54页 |
| 2.3.5 对重组pKS2载体pKS2-srfB-C-△Leu进行双酶切验证 | 第54页 |
| 2.3.6 对B.subtilis PB2-L1进行pKS2-srfB-C-△Leu重组载体诱导敲除 | 第54页 |
| 2.3.7 筛选Kan平板上对应的单菌落进行点板验证 | 第54-55页 |
| 2.3.8 对B.subtilis PB2-L1删除SurfactinB亚基D-Leu模块菌株进行验证 | 第55-56页 |
| 3 讨论 | 第56-57页 |
| 4 本章小结 | 第57-59页 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌产新型Surfactin衍生物结构鉴定和性质研究 | 第59-81页 |
| 1 材料与方法 | 第59-64页 |
| 1.1 材料 | 第59-61页 |
| 1.1.1 菌株与培养基 | 第59-60页 |
| 1.1.2 主要试剂与材料 | 第60页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第60-61页 |
| 1.2 实验方法 | 第61-64页 |
| 1.2.1 新型Surfactin衍生物结构鉴定方法 | 第61-63页 |
| 1.2.2 新型Surfactin衍生物性质研究方法 | 第63-64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-78页 |
| 2.1 新型Surfactin衍生物结构鉴定 | 第64-75页 |
| 2.1.1 枯草芽孢杆菌LS1产[△Leu~3] Surfactin结构鉴定结果 | 第64-69页 |
| 2.1.2 枯草芽孢杆菌LS6产[△Asp~5] Surfactin结构鉴定结果 | 第69-72页 |
| 2.1.3 枯草芽孢杆菌LS9产[△Leu~6] Surfactin结构鉴定结果 | 第72-75页 |
| 2.2 新型Surfactin衍生物性质研究 | 第75-78页 |
| 2.2.1 新型抗菌物质对热的稳定性 | 第75页 |
| 2.2.2 新型抗菌物质对酸碱的稳定性 | 第75-76页 |
| 2.2.3 紫外线对新型抗菌物质的影响 | 第76页 |
| 2.2.4 新型抗菌物质对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶的敏感性测定 | 第76页 |
| 2.2.5 不同溶剂对抗菌脂肽抗菌活性的影响 | 第76-77页 |
| 2.2.6 新型抗菌物质抗菌谱的测定 | 第77-78页 |
| 3 讨论 | 第78-80页 |
| 4 本章小结 | 第80-81页 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌LS-9产抗菌物质[△Leu~6] Surfactin培养基优化 | 第81-103页 |
| 1 材料与方法 | 第81-85页 |
| 1.1 材料 | 第81-82页 |
| 1.1.1 菌种 | 第81-82页 |
| 1.1.2 药品和试剂 | 第82页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第82页 |
| 1.2 试验方法 | 第82-85页 |
| 1.2.1 氮源初筛 | 第82-83页 |
| 1.2.2 碳源初筛 | 第83页 |
| 1.2.3 金属盐初筛 | 第83页 |
| 1.2.4 氨基酸初筛 | 第83页 |
| 1.2.5 硝酸钾对[△Leu~6] Surfactin合成的影响 | 第83页 |
| 1.2.6 蔗糖对[△Leu~6] Surfactin合成的影响 | 第83页 |
| 1.2.7 硫酸镁对[△Leu~6] Surfactin合成的影响 | 第83-84页 |
| 1.2.8 谷氨酸钠对[△Leu~6] Surfactin合成的影响 | 第84页 |
| 1.2.9 发酵时间 | 第84页 |
| 1.2.10 温度 | 第84页 |
| 1.2.11 初始pH | 第84-85页 |
| 1.2.12 接种量 | 第85页 |
| 1.2.13 [△Leu~6] Surfactin高效合成营养因子的筛选 | 第85页 |
| 1.2.14 响应曲面优化与验证 | 第85页 |
| 2 结果与分析 | 第85-99页 |
| 2.1 氮源初筛结果 | 第85-86页 |
| 2.2 碳源初筛结果 | 第86-87页 |
| 2.3 金属盐初筛结果 | 第87-88页 |
| 2.4 氨基酸初筛结果 | 第88-89页 |
| 2.5 硝酸钾对[△Leu~6] Surfactin合成的影响 | 第89-90页 |
| 2.6 蔗糖对[△Leu~6] Surfactin合成的影响 | 第90页 |
| 2.7 硫酸镁对[△Leu~6]Surfactin合成的影响 | 第90-91页 |
| 2.8 谷氨酸钠对[△Leu~6]Surfactin合成的影响 | 第91-92页 |
| 2.9 发酵时间对[△Leu~6]Surfactin合成的影响 | 第92页 |
| 2.10 温度对[△Leu~6] Surfactin合成的影响 | 第92-93页 |
| 2.11 初始pH对[△Leu~6]Surfactin合成的影响 | 第93-94页 |
| 2.12 接种量对[△Leu~6]Surftactin合成的影响 | 第94页 |
| 2.13 [△Leu~6] Surfactin高效合成营养因子的筛选结果 | 第94-96页 |
| 2.14 响应曲面分析 | 第96-98页 |
| 2.15 3D响应曲面 | 第98-99页 |
| 3 讨论 | 第99-101页 |
| 4 本章小结 | 第101-103页 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌LS-9产抗菌质[△Leu~6]Surfactin对串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌抑菌机制初探 | 第103-121页 |
| 1 材料与方法 | 第103-107页 |
| 1.1 材料 | 第103-104页 |
| 1.1.1 菌株 | 第103-104页 |
| 1.1.2 主要试剂与材料 | 第104页 |
| 1.1.3 主要仪器设备 | 第104页 |
| 1.2 实验方法 | 第104-107页 |
| 1.2.1 抗菌脂肽的制备 | 第104页 |
| 1.2.2 串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌生长曲线的测定 | 第104页 |
| 1.2.3 串珠镰刀菌菌丝生长抑制率和孢子抑制率的测定 | 第104-105页 |
| 1.2.4 测定新型抗菌脂肽最小抑菌浓度 | 第105页 |
| 1.2.5 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌菌丝表面形态的光学显微镜观察 | 第105页 |
| 1.2.6 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌菌丝表面形态的荧光显微镜观察 | 第105页 |
| 1.2.7 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌菌丝表面形态的影响及扫描电镜标本的制备 | 第105-106页 |
| 1.2.8 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌菌丝内部结构的影响及透射电镜标本的制备 | 第106页 |
| 1.2.9 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌孢子的影响 | 第106-107页 |
| 1.2.10 串珠镰刀菌基因组DNA的提取 | 第107页 |
| 1.2.11 [△Leu~6] Surfactin脂肽琼脂糖凝胶阻滞实验 | 第107页 |
| 1.2.12 ROS测定 | 第107页 |
| 2 结果与分析 | 第107-118页 |
| 2.1 串珠镰刀菌与禾谷镰刀菌生长曲线的测定 | 第107-108页 |
| 2.2 串珠镰刀菌菌丝生长抑制率和孢子抑制率的测定 | 第108-109页 |
| 2.3 新型抗菌脂肽最小抑菌浓度的测定 | 第109-110页 |
| 2.4 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌菌丝表面形态的光学显微镜观察 | 第110-111页 |
| 2.5 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌菌丝表面形态的荧光显微镜观察 | 第111-112页 |
| 2.6 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌菌丝表面形态的影响及扫描电镜观察 | 第112-113页 |
| 2.7 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌菌丝内部结构的影响及透射电镜观察 | 第113-114页 |
| 2.8 [△Leu~6] Surfactin脂肽对串珠镰刀菌孢子的影响 | 第114-115页 |
| 2.9 [△Leu~6] Surfactin脂肽琼脂糖凝胶阻滞实验 | 第115-116页 |
| 2.10 串珠镰刀菌菌丝经[△Leu~6]Surfactin脂肽处理后ROS测定 | 第116-118页 |
| 2.10.1 串珠镰刀菌菌丝经[△Leu~6]Surfactin处理对H_2O_2的变化 | 第116-117页 |
| 2.10.2 串珠镰刀菌菌丝经[△Leu~6]Surfactin处理对O_2~-的变化 | 第117页 |
| 2.10.3 串珠镰刀菌菌丝经[△Leu~6]Surfactin处理对OH·的变化 | 第117-118页 |
| 3 讨论 | 第118-120页 |
| 4 本章小结 | 第120-121页 |
| 第六章 利用iTRAQ技术对新型抗菌物质[△Leu~6]Surfactin影响禾谷镰刀菌差异蛋白表达谱的研究 | 第121-133页 |
| 1 材料与方法 | 第121-125页 |
| 1.1 材料 | 第121-122页 |
| 1.1.1 菌株 | 第121页 |
| 1.1.3 主要实验材料与试剂 | 第121-122页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第122页 |
| 1.2 实验方法 | 第122-125页 |
| 1.2.1 禾谷镰刀菌孢子液的制备 | 第122页 |
| 1.2.2 禾谷镰刀菌菌体的培养 | 第122页 |
| 1.2.3 禾谷镰刀菌菌体总蛋白的提取 | 第122-123页 |
| 1.2.4 禾谷镰刀菌菌体总蛋白的定量 | 第123页 |
| 1.2.5 禾谷镰刀菌菌体总蛋白的酶解 | 第123页 |
| 1.2.6 iTRAQ标记 | 第123页 |
| 1.2.7 提取禾谷镰刀菌总RNA | 第123页 |
| 1.2.8 反转录cDNA的合成 | 第123-124页 |
| 1.2.9 RT-PCR验证实验所需引物 | 第124-125页 |
| 1.2.10 RT-PCR反应体系和RT-PCR循环程序 | 第125页 |
| 2 结果与分析 | 第125-131页 |
| 2.1 禾谷镰刀菌菌体总蛋白的iTRAQ检测结果 | 第125-127页 |
| 2.1.1 蛋白质相对分子质量分布 | 第125页 |
| 2.1.2 Unique肽段分布数量 | 第125-126页 |
| 2.1.3 蛋白质序列覆盖分布 | 第126-127页 |
| 2.1.4 差异蛋白数量的变化 | 第127页 |
| 2.2 差异蛋白功能聚类分析 | 第127-129页 |
| 2.3 [△Leu~6] Surfactin对禾谷镰刀菌中差异蛋白上调基因表达量的影响 | 第129-130页 |
| 2.4 [△Leu~6] Surfactin对禾谷镰刀菌中差异蛋白下调基因表达量的影响 | 第130-131页 |
| 3 讨论 | 第131-132页 |
| 4 本章小结 | 第132-133页 |
| 第七章 枯草芽孢杆菌LS-9产[△Leu~6] Surfactin在玉米储藏中的应用 | 第133-149页 |
| 1 材料与方法 | 第133-136页 |
| 1.1 材料 | 第133-134页 |
| 1.1.1 菌株 | 第133页 |
| 1.1.2 培养基 | 第133-134页 |
| 1.1.3 主要实验材料与试剂 | 第134页 |
| 1.1.4 主要仪器设备 | 第134页 |
| 1.2 实验方法 | 第134-136页 |
| 1.2.1 伏马菌素B1产量的测定 | 第134页 |
| 1.2.2 伏马菌素B1抑制率的测定 | 第134-135页 |
| 1.2.3 人工模拟串珠镰刀菌污染玉米贮藏实验 | 第135页 |
| 1.2.4 串珠镰刀菌生长抑制率的测定 | 第135页 |
| 1.2.5 呕吐毒素(DON)产量的测定 | 第135页 |
| 1.2.6 呕吐毒素(DON)抑制率的测定 | 第135页 |
| 1.2.7 人工模拟禾谷镰刀菌污染玉米贮藏实验 | 第135-136页 |
| 1.2.8 禾谷镰刀菌生长抑制率的测定 | 第136页 |
| 2 结果与分析 | 第136-146页 |
| 2.1 串珠镰刀菌FB1的合成 | 第136页 |
| 2.2 不同[△Leu~6]Surfactin浓度下对FB1合成的影响 | 第136-137页 |
| 2.3 不同[△Leu~6]Surfactin浓度下对串珠镰刀菌生长的影响 | 第137-138页 |
| 2.4 人工模拟串珠镰刀菌污染玉米贮藏实验 | 第138-141页 |
| 2.4.1 不同[△Leu~6] Surfactin浓度下对玉米中串珠镰刀菌生长的影响 | 第138页 |
| 2.4.2 不同储藏时间对玉米中串珠镰刀菌生长的影响 | 第138-139页 |
| 2.4.3 不同储藏温度对玉米中串珠镰刀菌生长的影响 | 第139-140页 |
| 2.4.4 不同玉米含水量对玉米中串珠镰刀菌生长的影响 | 第140页 |
| 2.4.5 不同湿度对玉米中串珠镰刀菌生长的影响 | 第140-141页 |
| 2.5 呕吐毒素(DON)的合成 | 第141-142页 |
| 2.6 不同[△Leu~6] Surfactin浓度下对DON合成的影响 | 第142页 |
| 2.7 不同[△Leu~6]Surfactin浓度下对禾谷镰刀菌生长的影响 | 第142-143页 |
| 2.8 人工模拟禾谷镰刀菌污染玉米贮藏实验 | 第143-146页 |
| 2.8.1 不同[△Leu~6] Surfactin浓度下对玉米中禾谷镰刀菌生长的影响 | 第143-144页 |
| 2.8.2 不同储藏时间对玉米中禾谷镰刀菌生长的影响 | 第144页 |
| 2.8.3 不同储藏温度对玉米中禾谷镰刀菌生长的影响 | 第144-145页 |
| 2.8.4 不同玉米含水量对玉米中禾谷镰刀菌生长的影响 | 第145-146页 |
| 2.8.5 不同湿度对玉米中禾谷镰刀菌生长的影响 | 第146页 |
| 3 讨论 | 第146-148页 |
| 4 本章小结 | 第148-149页 |
| 参考文献 | 第149-157页 |
| 附录 | 第157-173页 |
| 全文结论 | 第173-175页 |
| 论文创新点 | 第175-177页 |
| 展望 | 第177-179页 |
| 致谢 | 第179-181页 |
| 攻读博士期间发表论文及申请专利情况 | 第181页 |
