| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 前言 | 第14-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-35页 |
| 1.1 β-香树脂醇概述 | 第15-20页 |
| 1.1.1 β-香树脂醇的结构与性质 | 第15页 |
| 1.1.2 β-香树脂醇的生物活性与用途 | 第15-16页 |
| 1.1.3 β-香树脂醇的来源 | 第16-18页 |
| 1.1.4 β-香树脂醇的生物合成途径及在三萜合成中的地位 | 第18-20页 |
| 1.2 工程化微生物细胞合成萜类化合物 | 第20-26页 |
| 1.2.1 工程化大肠杆菌合成萜类化合物 | 第20-22页 |
| 1.2.2 工程化酿酒酵母合成萜类化合物 | 第22-25页 |
| 1.2.3 酿酒酵母合成 β-香树脂醇的研究现状 | 第25-26页 |
| 1.3 酿酒酵母中人工途径的组装与调控 | 第26-34页 |
| 1.3.1 DNA与途径组装技术 | 第26-29页 |
| 1.3.2 酶表达水平的调控 | 第29-31页 |
| 1.3.3 代谢途径酶的空间定位 | 第31页 |
| 1.3.4 基于Cre/LoxP系统的基因敲除 | 第31-32页 |
| 1.3.5 ZENs和TALENs基因组编辑技术 | 第32-33页 |
| 1.3.6 CRISPR/ Cas介导的基因组编辑技术 | 第33-34页 |
| 1.4 本课题研究的内容和意义 | 第34-35页 |
| 第2章 β-香树脂醇合成途径在酿酒酵母中的构建 | 第35-55页 |
| 引言 | 第35页 |
| 2.1 材料 | 第35-39页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第35-37页 |
| 2.1.2 药品及试剂 | 第37-38页 |
| 2.1.3 仪器 | 第38-39页 |
| 2.1.4 培养基 | 第39页 |
| 2.2 方法 | 第39-49页 |
| 2.2.1 酿酒酵母的培养 | 第39-40页 |
| 2.2.2 酵母基因组的提取 | 第40页 |
| 2.2.3 目标片段的扩增与基因表达盒构建 | 第40-42页 |
| 2.2.4 质粒的线性化 | 第42页 |
| 2.2.5 DNA与质粒的组装 | 第42-43页 |
| 2.2.6 酵母总RNA的提取及反转录 | 第43-44页 |
| 2.2.7 基因表达水平检测 | 第44-46页 |
| 2.2.8 菌体生物量的测定 | 第46-47页 |
| 2.2.9 β-香树脂醇及其它代谢物的提取与测定 | 第47-49页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第49-53页 |
| 2.3.1 β-香树脂醇合成途径在酿酒酵母中的构建 | 第49-50页 |
| 2.3.2 β-香树脂醇合酶在酿酒酵母中的转录情况 | 第50-51页 |
| 2.3.3 酿酒酵母工程菌SpKb发酵产物的鉴定 | 第51-52页 |
| 2.3.4 不同表达载体对 β-香树脂醇合成的影响 | 第52-53页 |
| 2.4 小结 | 第53-55页 |
| 第3章 平衡前体物鲨烯代谢提高 β-香树脂醇合成 | 第55-78页 |
| 引言 | 第55-56页 |
| 3.1 材料 | 第56-58页 |
| 3.1.1 菌种与质粒 | 第56-57页 |
| 3.1.2 药品及试剂 | 第57页 |
| 3.1.3 仪器 | 第57页 |
| 3.1.4 培养基 | 第57-58页 |
| 3.2 方法 | 第58-68页 |
| 3.2.1 酵母基因组的提取 | 第58页 |
| 3.2.2 大肠杆菌的基因组提取 | 第58页 |
| 3.2.3 途径的构建与组装方法 | 第58-59页 |
| 3.2.4 过表达鲨烯单加氧酶工程菌株的构建 | 第59-62页 |
| 3.2.5 强化鲨烯合成工程菌的构建 | 第62-64页 |
| 3.2.6 SRE在启动子中的重构与工程菌构建方法 | 第64-66页 |
| 3.2.7 基因表达分析 | 第66页 |
| 3.2.8 绿色荧光蛋白荧光强度检测方法 | 第66-67页 |
| 3.2.9 其他分析方法 | 第67-68页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第68-77页 |
| 3.3.1 外源鲨烯单加氧酶的表达与效果 | 第68-70页 |
| 3.3.2 强化鲨烯供应提高 β-香树脂醇合成 | 第70-72页 |
| 3.3.3 利用UPC2结合位点重构启动子增强途径表达效率 | 第72-74页 |
| 3.3.4 过表达UPC2-1 对 β-香树脂醇合成的影响 | 第74-77页 |
| 3.4 小结 | 第77-78页 |
| 第4章 CRISPR/d Cas9修饰酵母内源途径优化 β-香树脂醇合成 | 第78-100页 |
| 引言 | 第78-79页 |
| 4.1 材料 | 第79-80页 |
| 4.1.1 菌种与质粒 | 第79页 |
| 4.1.2 药品及试剂 | 第79-80页 |
| 4.1.3 仪器 | 第80页 |
| 4.1.4 培养基 | 第80页 |
| 4.2 方法 | 第80-90页 |
| 4.2.1 目标片段的扩增与基因表达盒构建 | 第80-81页 |
| 4.2.2 途径的构建与组装方法 | 第81页 |
| 4.2.3 表达dCas9蛋白工程菌的构建 | 第81-82页 |
| 4.2.4 CRISPR/dCas9验证系统的构建 | 第82-84页 |
| 4.2.5 乙酰辅酶A合成强化工程菌的构建方法 | 第84-86页 |
| 4.2.6 目标基因gRNA的设计与工程菌构建 | 第86-89页 |
| 4.2.7 基因表达分析 | 第89页 |
| 4.2.8 β-半乳糖苷酶活性的测定 | 第89-90页 |
| 4.2.9 其他分析方法 | 第90页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第90-99页 |
| 4.3.1 酿酒酵母中CRISPR/dCas9的设计 | 第90-91页 |
| 4.3.2 dCas9蛋白表达模块的构建 | 第91-92页 |
| 4.3.3 CRISPR/dCas9在酿酒酵母中的功能验证 | 第92-94页 |
| 4.3.4 CRISPR/dCas9下调羊毛甾醇合酶 | 第94-96页 |
| 4.3.5 强化胞质乙酰辅酶A合成 | 第96-97页 |
| 4.3.6 CRISPR/dCas9一步多基因修饰 β-香树脂醇合成途径 | 第97-99页 |
| 4.4 小结 | 第99-100页 |
| 第5章 产 β-香树脂醇酿酒酵母的发酵工艺优化 | 第100-108页 |
| 引言 | 第100页 |
| 5.1 材料 | 第100-101页 |
| 5.1.1 菌种 | 第100页 |
| 5.1.2 药品及试剂 | 第100页 |
| 5.1.3 仪器 | 第100-101页 |
| 5.1.4 培养基 | 第101页 |
| 5.2 方法 | 第101-102页 |
| 5.2.1 种子液的制备 | 第101页 |
| 5.2.2 2.5L发酵罐培养 | 第101页 |
| 5.2.3 葡萄糖和乙醇浓度的测定 | 第101-102页 |
| 5.2.4 其他分析方法 | 第102页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第102-107页 |
| 5.3.1 基础培养条件的优化 | 第102-104页 |
| 5.3.2 葡萄糖补料发酵 | 第104-105页 |
| 5.3.3 乙醇补料发酵 | 第105-106页 |
| 5.3.4 甲基-β-环糊精对 β-香树脂醇合成的影响 | 第106-107页 |
| 5.4 小结 | 第107-108页 |
| 第6章 结论与展望 | 第108-110页 |
| 6.1 结论 | 第108-109页 |
| 6.2 创新点 | 第109页 |
| 6.3 对今后工作的建议与展望 | 第109-110页 |
| 参考文献 | 第110-124页 |
| 攻读学位期间主要研究成果 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 作者简介 | 第126页 |
