| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 1 绪论 | 第24-45页 |
| 1.1 嗜麦芽单胞菌的生物学特征 | 第24-27页 |
| 1.1.1 嗜麦芽单胞菌的分类 | 第24页 |
| 1.1.2 嗜麦芽单胞菌的形态及生化特征 | 第24-25页 |
| 1.1.3 嗜麦芽单胞菌条件致病性及耐药性 | 第25-26页 |
| 1.1.4 嗜麦芽单胞菌温度相关的特性 | 第26-27页 |
| 1.1.5 嗜麦芽单胞菌的分布 | 第27页 |
| 1.2 蛋白酶 | 第27-29页 |
| 1.2.1 蛋白酶的定义及分类 | 第27-28页 |
| 1.2.2 丝氨酸蛋白酶 | 第28页 |
| 1.2.3 Subtilisin的催化成熟过程 | 第28-29页 |
| 1.3 温度作为外界环境信号的调控 | 第29-37页 |
| 1.3.1 RNA作为温度感受元件 | 第29-30页 |
| 1.3.2 DNA作为温度感受元件 | 第30-32页 |
| 1.3.3 蛋白作为温度感受元件 | 第32-37页 |
| 1.4 细菌第二信使c-di-GMP | 第37-42页 |
| 1.4.1 c-di-GMP代谢 | 第37-41页 |
| 1.4.2 c-di-GMP的代谢调控 | 第41-42页 |
| 1.5 立题依据、研究内容及意义 | 第42-45页 |
| 1.5.1 立题依据 | 第42-43页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第43页 |
| 1.5.3 研究意义 | 第43-45页 |
| 2 低温下高产蛋白酶菌株的筛选及蛋白酶鉴定 | 第45-66页 |
| 2.1 引言 | 第45页 |
| 2.2 实验材料 | 第45-47页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第45页 |
| 2.2.2 培养基及溶液配制 | 第45-46页 |
| 2.2.3 主要生化试剂、分子试剂和试剂盒 | 第46页 |
| 2.2.4 实验仪器设备 | 第46-47页 |
| 2.3 实验方法 | 第47-53页 |
| 2.3.1 低温下高产蛋白酶菌种的筛分 | 第47-48页 |
| 2.3.2 低温下高产蛋白酶菌种鉴定 | 第48页 |
| 2.3.3 不同温度下菌株生长及蛋白酶活性动力学测定 | 第48页 |
| 2.3.4 蛋白酶SmtP的分离纯化 | 第48-49页 |
| 2.3.5 SmtP酶学性质测定 | 第49-50页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶谱分析 | 第50页 |
| 2.3.7 ESI-MS-MS | 第50页 |
| 2.3.8 smtP全基因的克隆 | 第50-52页 |
| 2.3.9 SmtP的N端序列的测定 | 第52页 |
| 2.3.10 SmtP一级结构解析及系统发育树的构建 | 第52-53页 |
| 2.4 结果与分析 | 第53-64页 |
| 2.4.1 低温下高产蛋白酶菌株的筛选 | 第53页 |
| 2.4.2 低温下高产蛋白酶菌株的鉴定 | 第53-54页 |
| 2.4.3 不同温度下菌株FF11生长及蛋白酶动力学曲线 | 第54-55页 |
| 2.4.4 SmtP的分离纯化 | 第55-56页 |
| 2.4.5 SmtP的纯度鉴定及分子量 | 第56页 |
| 2.4.6 pH对SmtP酶活影响 | 第56-57页 |
| 2.4.7 温度对SmtP酶活影响 | 第57-58页 |
| 2.4.8 NaCl对SmtP酶活影响 | 第58页 |
| 2.4.9 蛋白酶抑制剂对SmtP酶活影响 | 第58-59页 |
| 2.4.10 金属离子对SmtP酶活影响 | 第59-60页 |
| 2.4.11 有机试剂对SmtP酶活影响 | 第60-61页 |
| 2.4.12 smtP基因克隆 | 第61-62页 |
| 2.4.13 SmtP一级结构序列及系统发育树构建 | 第62-64页 |
| 2.5 讨论 | 第64-65页 |
| 2.6 本章小结 | 第65-66页 |
| 3 S.maltophilia FF11中转录因子Clp对SmtP的调控 | 第66-83页 |
| 3.1 引言 | 第66页 |
| 3.2 实验材料 | 第66-69页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第66-67页 |
| 3.2.2 培养基及溶液的配置 | 第67-68页 |
| 3.2.3 本章所用的PCR引物 | 第68-69页 |
| 3.2.4 实验试剂及仪器 | 第69页 |
| 3.3 实验方法 | 第69-73页 |
| 3.3.1 S. maltophilia FF11耐药性测定 | 第69页 |
| 3.3.2 启动子融合质粒的构建 | 第69页 |
| 3.3.3 敲除和回补菌株的构建 | 第69-71页 |
| 3.3.4 不同温度下野生型与Aclp菌株生长及蛋白酶活性测定 | 第71页 |
| 3.3.5 实时定量PCR | 第71-72页 |
| 3.3.6 β-葡糖苷酸酶的活性测定 | 第72-73页 |
| 3.4 结果和分析 | 第73-81页 |
| 3.4.1 温度影响SmtP的产生至少发生在转录水平上 | 第73-74页 |
| 3.4.2 S. maltophilia FF11的耐药性分析 | 第74-75页 |
| 3.4.3 clp敲除菌株及回补菌株的获得 | 第75-78页 |
| 3.4.4 clp敲除菌株在不同温度下的蛋白酶活性 | 第78-79页 |
| 3.4.5 clp敲除菌株在不同温度下的生长特征 | 第79-80页 |
| 3.4.6 clp的表达具有温度依赖性 | 第80-81页 |
| 3.5 讨论 | 第81-82页 |
| 3.6 本章小结 | 第82-83页 |
| 4 温度响应的信号传导系统LotS/LotR/Clp对SmtP调控 | 第83-107页 |
| 4.1 引言 | 第83-84页 |
| 4.2 实验材料 | 第84-88页 |
| 4.2.1 培养基及溶液的配置 | 第84页 |
| 4.2.2 菌株与质粒 | 第84-86页 |
| 4.2.3 本章所用PCR引物 | 第86-88页 |
| 4.2.4 实验仪器及设备 | 第88页 |
| 4.3 实验方法 | 第88-91页 |
| 4.3.1 敲除与回补菌株的构建 | 第88页 |
| 4.3.2 不同温度下野生型和敲除菌株生长及胞外蛋白酶活性测定 | 第88-89页 |
| 4.3.3 β-葡糖苷酸酶活性的测定 | 第89页 |
| 4.3.4 LotR和LotS生物信息学分析 | 第89页 |
| 4.3.5 LotR的DGC和PDE活性测定 | 第89-90页 |
| 4.3.6 ITC检测不同温度下Clp与c-di-GMP结合 | 第90-91页 |
| 4.3.7 胞内c-di-GMP含量的测定 | 第91页 |
| 4.4 结果与分析 | 第91-105页 |
| 4.4.1 S.maltophilia中与c-di-GMP代谢相关的双组份系统分析 | 第91-92页 |
| 4.4.2 敲除及回补菌株的获得 | 第92-96页 |
| 4.4.3 LotS与LotR共转录分析 | 第96-97页 |
| 4.4.4 LotS/LotR参与了温度对smtP的表达调控 | 第97-99页 |
| 4.4.5 转录因子Clp是LotS/LotR的下游调节蛋白 | 第99-100页 |
| 4.4.6 LotR的酶活分析 | 第100-102页 |
| 4.4.7 温度对Clp与c-di-GMP亲和性的影响 | 第102-104页 |
| 4.4.8 温度和LotR对菌体胞内c-di-GMP水平的影响 | 第104-105页 |
| 4.5 讨论 | 第105-106页 |
| 4.6 本章小结 | 第106-107页 |
| 5 双组份系统RpfC/RpfG响应温度和DSF信号对SmtP调控 | 第107-125页 |
| 5.1 引言 | 第107页 |
| 5.2 实验材料 | 第107-110页 |
| 5.2.1 培养基及溶液的配置 | 第107-108页 |
| 5.2.2 菌株与质粒 | 第108页 |
| 5.2.3 本章所用的PCR引物 | 第108-110页 |
| 5.2.4 实验仪器及设备 | 第110页 |
| 5.3 实验方法 | 第110-111页 |
| 5.3.1 S. maltophilia FF11中rpf基因簇生物信息学分析 | 第110页 |
| 5.3.2 敲除菌株及回补菌株的构建 | 第110页 |
| 5.3.3 不同温度下△rpfC和△rpfG的胞外蛋白酶活性测定 | 第110页 |
| 5.3.4 不同温度下△rpfC和△rpfG的菌体生长曲线测定 | 第110页 |
| 5.3.5 RpfG的PDE活性测定 | 第110-111页 |
| 5.4 结果与分析 | 第111-123页 |
| 5.4.1 S.maltophilia中RpfC与RpfG生物信息学分析 | 第111-112页 |
| 5.4.2 敲除与回补菌株的获得 | 第112-117页 |
| 5.4.3 DSF通过RpfC/RpfG影响胞外蛋白酶的产生 | 第117-118页 |
| 5.4.4 不同温度下△rpfC及△rpfG胞外蛋白酶活性 | 第118-119页 |
| 5.4.5 不同温度下△rpfC及△rpfG菌株的生长曲线 | 第119-120页 |
| 5.4.6 DSF信号仅在低温环境下调控胞外酶的产生 | 第120-121页 |
| 5.4.7 温度和DSF信号对RpfG的酶活影响 | 第121-123页 |
| 5.5 讨论 | 第123-124页 |
| 5.6 本章小结 | 第124-125页 |
| 6 结论与展望 | 第125-127页 |
| 6.1 结论 | 第125-126页 |
| 6.2 创新点 | 第126页 |
| 6.3 展望 | 第126-127页 |
| 参考文献 | 第127-139页 |
| 附录 | 第139-140页 |
| 作者简介 | 第140页 |
| 攻读博士学位期间科研成果 | 第140-141页 |
| 致谢 | 第141页 |
