| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略语 | 第7-12页 |
| 第1章 引言 | 第12-24页 |
| 1.1 有机磷农药 | 第12-16页 |
| 1.1.1 有机磷农药的毒性、残留现状及危害 | 第12-13页 |
| 1.1.2 有机磷农药的中毒机理 | 第13页 |
| 1.1.3 几种有机磷农药的限量标准 | 第13-16页 |
| 1.2 有机磷农药的检测方法研究进展 | 第16-18页 |
| 1.2.1 免疫分析技术 | 第17-18页 |
| 1.2.2 有机磷农药多残留酶联免疫分析技术的研究进展 | 第18页 |
| 1.3 人工抗原的设计与合成 | 第18-19页 |
| 1.4 基因工程抗体制备技术研究 | 第19-22页 |
| 1.4.1 scFv的结构 | 第19-20页 |
| 1.4.2 单链抗体的表达系统 | 第20-22页 |
| 1.5 主要研究内容和意义 | 第22-24页 |
| 1.5.1 主要研究内容 | 第22-23页 |
| 1.5.2 本研究的意义 | 第23-24页 |
| 第2章 抗体可变区基因的克隆及三维结构模拟分析 | 第24-33页 |
| 2.1 主要材料及培养基 | 第24-25页 |
| 2.1.1 主要材料 | 第24页 |
| 2.1.2 主要培养基 | 第24-25页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第25-28页 |
| 2.2.1 抗体重、轻链可变区基因的扩增 | 第25-28页 |
| 2.2.2 可变区氨基酸序列分析及其空间结构预测 | 第28页 |
| 2.2.3 分子对接及scFv基因模拟突变 | 第28页 |
| 2.3 结果与分析 | 第28-32页 |
| 2.3.1 VL/VH基因的扩增 | 第28-29页 |
| 2.3.2 抗体可变区基因结构分析 | 第29-30页 |
| 2.3.3 同源建模、分子对接 | 第30-32页 |
| 2.4 讨论 | 第32页 |
| 2.5 小结 | 第32-33页 |
| 第3章 单链抗体的原核表达及条件优化 | 第33-51页 |
| 3.1 材料、试剂与仪器 | 第33-35页 |
| 3.1.1 主要材料 | 第33页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第33-34页 |
| 3.1.3 主要溶液和培养基 | 第34-35页 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 | 第35页 |
| 3.2 方法与步骤 | 第35-43页 |
| 3.2.1 scFv基因的构建 | 第35-37页 |
| 3.2.2 表达载体的构建 | 第37-39页 |
| 3.2.3 原核表达条件优化 | 第39-40页 |
| 3.2.4 SDS-PAGE分析目的蛋白 | 第40-41页 |
| 3.2.5 周质蛋白的提取 | 第41-42页 |
| 3.2.6 蛋白的纯化 | 第42页 |
| 3.2.7 Western blot (WB)分析目的蛋白 | 第42页 |
| 3.2.8 透析 | 第42-43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-49页 |
| 3.3.1 scFv及其scFv(M)基因的构建 | 第43-44页 |
| 3.3.2 表达载体pET26b-scFv，pET26b-scFv(M)的构建 | 第44-45页 |
| 3.3.3 pET26b-scFv诱导表达 | 第45-48页 |
| 3.3.4 pET26b-scFv(M)诱导表达 | 第48-49页 |
| 3.4 讨论 | 第49页 |
| 3.5 小结 | 第49-51页 |
| 第4章 突变前后单链抗体活性分析鉴定 | 第51-63页 |
| 4.1 材料、试剂和仪器 | 第51-52页 |
| 4.1.1 主要材料 | 第51页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第51页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第51-52页 |
| 4.2 ic-ELISA的建立及条件优化 | 第52-54页 |
| 4.2.1 工作浓度优化 | 第52页 |
| 4.2.2 ic-ELISA方法的建立 | 第52-53页 |
| 4.2.3 理化参数的优化 | 第53页 |
| 4.2.4 交叉反应率的测定 | 第53-54页 |
| 4.3 实际样品的方法验证 | 第54页 |
| 4.3.1 样品的前处理 | 第54页 |
| 4.3.2 加标回收 | 第54页 |
| 4.4 结果与分析 | 第54-61页 |
| 4.4.1 包被原、单链抗体最佳工作浓度的确定 | 第54-55页 |
| 4.4.2 间接竞争ELISA理化参数的优化 | 第55-57页 |
| 4.4.3 标准曲线的建立 | 第57-58页 |
| 4.4.4 单链抗体对不同有机磷类农药敏感性检测 | 第58-60页 |
| 4.4.5 实际样品的方法验证 | 第60-61页 |
| 4.5 讨论 | 第61-62页 |
| 4.5.1 ic-ELISA理化参数的优化 | 第61页 |
| 4.5.2 单链抗体对多种有机磷农药交叉反应率的测定 | 第61-62页 |
| 4.6 小结 | 第62-63页 |
| 第5章 单链抗体的真核表达 | 第63-74页 |
| 5.1 材料、仪器与试剂 | 第63-65页 |
| 5.1.1 主要材料 | 第63-64页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第64页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第64页 |
| 5.1.4 引物设计 | 第64-65页 |
| 5.2 实验步骤 | 第65-67页 |
| 5.2.1 表达载体的构建 | 第65-66页 |
| 5.2.2 重组质粒的验证 | 第66-67页 |
| 5.3 CHO-S表达重组抗体 | 第67-69页 |
| 5.3.1 CHO细胞的常规培养 | 第67-68页 |
| 5.3.2 CHO细胞的转染 | 第68-69页 |
| 5.3.3 收集蛋白 | 第69页 |
| 5.3.4 蛋白的纯化 | 第69页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第69-72页 |
| 5.4.1 表达载体pCHO1.0-scFv(M)的构建 | 第69-70页 |
| 5.4.2 CHO-S细胞表达 | 第70-72页 |
| 5.5 讨论 | 第72-73页 |
| 5.6 小结 | 第73-74页 |
| 第6章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 6.1 结论 | 第74页 |
| 6.2 展望 | 第74-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-82页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第82页 |
