| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第1章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 课题的研究背景与目的意义 | 第10-11页 |
| 1.2 盐胁迫与细菌分裂增殖 | 第11-14页 |
| 1.2.1 细菌分裂增殖机制 | 第11页 |
| 1.2.2 盐胁迫对细胞分裂增殖的影响 | 第11-12页 |
| 1.2.3 相容性溶质在盐胁迫菌体分裂增殖方面的保护作用 | 第12-13页 |
| 1.2.4 细胞主要分裂蛋白及其功能 | 第13-14页 |
| 1.3 细菌胁迫响应因子 | 第14-16页 |
| 1.3.1 信号响应因子 | 第14-15页 |
| 1.3.2 膜转运蛋白 | 第15-16页 |
| 1.4 基因敲除技术 | 第16-18页 |
| 1.4.1 基因敲除介绍 | 第16页 |
| 1.4.2 基因敲除的策略 | 第16-18页 |
| 1.4.3 基因敲除技术的应用 | 第18页 |
| 1.5 课题主要研究内容 | 第18-19页 |
| 1.6 技术路线 | 第19-20页 |
| 第2章 材料和方法 | 第20-38页 |
| 2.1 材料和仪器 | 第20-23页 |
| 2.1.1 材料与试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第21-22页 |
| 2.1.3 菌株和质粒 | 第22-23页 |
| 2.1.4 菌体活化及培养基 | 第23页 |
| 2.2 L.bulgaricus 34.5总RNA的提取和定量 | 第23-24页 |
| 2.3 反转录制备cDNA | 第24-25页 |
| 2.4 基因选取和荧光定量PCR引物的设计与合成 | 第25-27页 |
| 2.5 普通PCR检测引物特异性 | 第27页 |
| 2.6 实时荧光定量PCR检测基因转录表达差异 | 第27-28页 |
| 2.7 基因敲除中间载体pUC19-F的构建与鉴定 | 第28-34页 |
| 2.7.1 L.bulgaricus 34.5全基因组DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.7.2 敲除引物的设计与扩增 | 第30页 |
| 2.7.3 目的基因纯化 | 第30-31页 |
| 2.7.4 PCR纯化产物与pUC 19载体连接 | 第31-32页 |
| 2.7.5 重组质粒pUC 19-F的转化 | 第32页 |
| 2.7.6 重组质粒pUC 19-F的提取 | 第32-33页 |
| 2.7.7 酶切验证 | 第33页 |
| 2.7.8 测序分析 | 第33-34页 |
| 2.8 基因敲除载体pUC 19-F-t的构建与鉴定 | 第34-36页 |
| 2.8.1 抗性基因tet引物的设计与扩增 | 第34-35页 |
| 2.8.2 抗性基因tet纯化 | 第35页 |
| 2.8.3 PCR纯化产物与pUC 19-F载体连接 | 第35页 |
| 2.8.4 重组质粒pUC 19-F-t的转化 | 第35页 |
| 2.8.7 重组质粒pUC 19-F-t的提取 | 第35页 |
| 2.8.8 酶切验证 | 第35页 |
| 2.8.9 测序分析 | 第35-36页 |
| 2.9 基因敲除突变株的构建与筛选 | 第36页 |
| 2.9.1 L.bulgaricus 34.5感受态细胞的制备与电转化 | 第36页 |
| 2.9.2 基因敲除突变株的筛选 | 第36页 |
| 2.9.3 二次PCR验证 | 第36页 |
| 2.9.4 测序验证 | 第36页 |
| 2.10 生长曲线的建立 | 第36-37页 |
| 2.11 菌体形态观察 | 第37页 |
| 2.12 分裂基因表达量分析 | 第37页 |
| 2.13 数据处理及分析 | 第37-38页 |
| 第3章 盐胁迫条件下保加利亚乳杆菌相关胁迫响应因子表达水平分析 | 第38-51页 |
| 3.1 保加利亚乳杆菌总RNA提取与反转录 | 第38-40页 |
| 3.1.1 L.bulgaricus 34.5总RNA提取和定量 | 第38-39页 |
| 3.1.2 cDNA的合成及其质量检测 | 第39-40页 |
| 3.2 引物特异性检测 | 第40-42页 |
| 3.2.1 信号响应因子的引物设计与特异性检测 | 第40-41页 |
| 3.2.2 膜转运相关基因的引物设计与特异性检测 | 第41-42页 |
| 3.3 盐胁迫响应因子的表达水平分析 | 第42-49页 |
| 3.3.1 信号响应因子响应盐胁迫表达量分析 | 第42-45页 |
| 3.3.2 膜转运相关基因响应盐胁迫的表达量分析 | 第45-49页 |
| 3.4 本章小结 | 第49-51页 |
| 第4章 保加利亚乳杆菌feoA基因敲除突变株的构建 | 第51-62页 |
| 4.1 L.bulgaricus 34.5基因敲除载体的构建 | 第51-58页 |
| 4.1.1 重组质粒pUC 19-F的构建与鉴定 | 第51-55页 |
| 4.1.2 重组质粒pUC 19-F-t的构建与鉴定 | 第55-58页 |
| 4.2 L.bulgaricus 34.5基因敲除突变株的构建 | 第58-60页 |
| 4.2.1 L.bulgaricus 34.5基因敲除突变株的筛选与验证 | 第58-60页 |
| 4.2.2 L.bulgaricus 34.5基因敲除突变株的二次PCR验证 | 第60页 |
| 4.3 本章小结 | 第60-62页 |
| 第5章 L.bulgaricus 34.5菌株feoA基因缺失对分裂增殖的影响研究 | 第62-72页 |
| 5.1 L.bulgaricus 34.5野生型与突变体生长曲线差异分析 | 第62-63页 |
| 5.2 L.bulgaricus 34.5野生型与突变体菌体形态差异分析 | 第63-65页 |
| 5.2.1 野生型菌株不同生长时期的细胞形态差异 | 第63-64页 |
| 5.2.2 突变型菌株不同生长时期的细胞形态差异 | 第64-65页 |
| 5.3 L.bulgaricus 34.5突变型的分裂相关基因表达水平分析 | 第65-70页 |
| 5.3.1 分裂相关基因的引物特异性检测 | 第65-66页 |
| 5.3.2 基因ftsZ的表达水平分析 | 第66-67页 |
| 5.3.3 基因mbl的表达水平分析 | 第67-69页 |
| 5.3.4 基因mreB的表达水平分析 | 第69-70页 |
| 5.4 本章小结 | 第70-72页 |
| 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 附录 | 第80-83页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
