| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-26页 |
| 1 红曲菌 | 第14-16页 |
| 1.1 红曲菌的生物学特征 | 第14页 |
| 1.2 红曲菌的分类 | 第14-15页 |
| 1.3 红曲菌的主要代谢产物 | 第15-16页 |
| 1.3.1 红曲色素 | 第15页 |
| 1.3.2 桔霉素 | 第15-16页 |
| 1.3.3 其它活性物质 | 第16页 |
| 2 G蛋白 | 第16-20页 |
| 2.1 G蛋白及其偶联的信号转导途径 | 第16-18页 |
| 2.1.1 G蛋白的结构和种类 | 第16-17页 |
| 2.1.2 G蛋白偶联的信号转导途径 | 第17-18页 |
| 2.2 G蛋白β与γ亚基的结构和功能 | 第18-19页 |
| 2.3 真菌中G蛋白β与γ亚基基因的研究进展 | 第19-20页 |
| 3 丝状真菌基因功能研究的方法 | 第20-24页 |
| 3.1 丝状真菌的遗传转化方法 | 第20-22页 |
| 3.1.1 PEG介导的原生质体的转化 | 第21页 |
| 3.1.2 电激转化 | 第21页 |
| 3.1.3 限制性内切酶介导的遗传转化 | 第21-22页 |
| 3.1.4 根癌农杆菌介导的遗传转化 | 第22页 |
| 3.2 基因敲除 | 第22-23页 |
| 3.3 RNA干扰 | 第23-24页 |
| 3.4 过表达 | 第24页 |
| 4 研究目的、意义、内容与路线 | 第24-26页 |
| 4.1 目的与意义 | 第24-25页 |
| 4.2 主要研究内容 | 第25页 |
| 4.3 研究路线 | 第25-26页 |
| 第二章 红色红曲菌G蛋白β和γ亚基基因缺失菌株的构建 | 第26-46页 |
| 1 材料 | 第26-28页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第26页 |
| 1.2 培养基 | 第26-27页 |
| 1.3 主要试剂 | 第27页 |
| 1.4 农杆菌介导的转化所需试剂和培养基 | 第27-28页 |
| 1.5 主要仪器与设备 | 第28页 |
| 1.6 基因序列 | 第28页 |
| 2 方法 | 第28-36页 |
| 2.1 红曲菌基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2 大肠杆菌感受态的制备,转化及质粒提取 | 第29页 |
| 2.2.1 CaCl_2法制备大肠杆菌DH5α感受态 | 第29页 |
| 2.2.2 热激法转化大肠杆菌DH5α | 第29页 |
| 2.2.3 碱裂解法提取质粒 | 第29页 |
| 2.3 G蛋白β和γ亚基基因敲除载体的构建 | 第29-33页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第29-30页 |
| 2.3.2 构建敲除盒 | 第30-32页 |
| 2.3.3 构建敲除载体 | 第32-33页 |
| 2.4 敲除载体转化农杆菌 | 第33-34页 |
| 2.4.1 农杆菌EHA105感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2.4.2 冻融法将质粒转入农杆菌 | 第33-34页 |
| 2.5 农杆菌介导的红曲菌转化 | 第34-35页 |
| 2.5.1 红曲菌孢子的制备 | 第34页 |
| 2.5.2 农杆菌的诱导 | 第34页 |
| 2.5.3 红曲菌孢子与农杆菌共培养 | 第34页 |
| 2.5.4 转化子的筛选 | 第34-35页 |
| 2.6 敲除子的筛选及验证 | 第35-36页 |
| 2.6.1 PCR方法筛选红曲菌突变子 | 第35-36页 |
| 2.6.2 Southern杂交验证 | 第36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-44页 |
| 3.1 G蛋白β亚基和γ亚基的生物信息学分析 | 第36-38页 |
| 3.2 敲除盒的构建 | 第38-39页 |
| 3.3 敲除载体的构建及验证 | 第39-40页 |
| 3.4 敲除载体转化农杆菌 | 第40页 |
| 3.5 ΔMgb1和ΔMgg1突变子的PCR筛选与验证 | 第40-41页 |
| 3.6 ΔMgb1和ΔMgg1突变子的Southern杂交验证 | 第41-42页 |
| 3.7 ΔMgb1ΔMgg1突变子的筛选及验证 | 第42-44页 |
| 3.7.1 ΔMgb1 ΔMgg1突变子的PCR筛选与验证 | 第42-43页 |
| 3.7.2 ΔMgb1 ΔMgg1突变子的Southern杂交验证 | 第43-44页 |
| 4 小结与讨论 | 第44-46页 |
| 4.1 小结 | 第44-45页 |
| 4.2 讨论 | 第45-46页 |
| 第三章 红色红曲菌G蛋白β和γ亚基基因缺失突变子分析 | 第46-52页 |
| 1 材料 | 第46-47页 |
| 1.1 菌株 | 第46页 |
| 1.2 培养基 | 第46-47页 |
| 2 方法 | 第47页 |
| 2.1 缺失突变子的菌落形态和显微特征观察 | 第47页 |
| 2.2 缺失突变子的YES发酵分析 | 第47页 |
| 2.2.1 缺失突变子生物量的分析 | 第47页 |
| 2.2.2 缺失突变子色素的测定 | 第47页 |
| 2.2.3 缺失突变子桔霉素的测定 | 第47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-50页 |
| 3.1 缺失突变子的菌落形态和显微特征 | 第47-49页 |
| 3.2 缺失突变子生物量的分析 | 第49页 |
| 3.3 缺失突变子产色素及桔霉素的分析 | 第49-50页 |
| 4 小结与讨论 | 第50-52页 |
| 4.1 小结 | 第50-51页 |
| 4.2 讨论 | 第51-52页 |
| 第四章 红色红曲菌G蛋白β和γ亚基基因过表达载体的构建及突变子分析 | 第52-65页 |
| 1 材料 | 第52页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第52页 |
| 1.2 培养基、主要试剂及主要实验仪器 | 第52页 |
| 2 方法 | 第52-58页 |
| 2.1 引物设计 | 第52-53页 |
| 2.2 构建过表达载体 | 第53-55页 |
| 2.2.1 构建G蛋白β亚基Mgb1基因过表达载体 | 第53-55页 |
| 2.2.2 构建G蛋白γ亚基Mgg1基因过表达载体 | 第55页 |
| 2.3 农杆菌介导的红曲菌转化 | 第55页 |
| 2.4 突变子的筛选及验证 | 第55-57页 |
| 2.5 突变子的性质分析 | 第57-58页 |
| 2.5.1 突变子的菌落形态和显微特征 | 第57-58页 |
| 2.5.2 突变子的YES发酵分析 | 第58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-64页 |
| 3.1 过表达突变载体的构建 | 第58-60页 |
| 3.1.1 G蛋白β亚基Mgb1基因过表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 3.1.2 G蛋白γ亚基Mgg1基因过表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 3.2 突变子的筛选及验证 | 第60-61页 |
| 3.3 突变子的功能分析 | 第61-64页 |
| 3.3.1 突变子的菌落形态和显微特征 | 第61-62页 |
| 3.3.2 突变子的生物量分析 | 第62-63页 |
| 3.3.3 突变子产色素及桔霉素的分析 | 第63-64页 |
| 4 小结与讨论 | 第64-65页 |
| 4.1 小结 | 第64页 |
| 4.2 讨论 | 第64-65页 |
| 第五章 结论与展望 | 第65-67页 |
| 1 结论 | 第65-66页 |
| 2 展望 | 第66页 |
| 3 创新点 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 附录1 Mgb1的DNA序列 | 第75-78页 |
| 附录2 Mgb1编码的氨基酸序列 | 第78页 |
| 附录3 Mgb1氨基酸序列的CLUSTAL W多重比对 | 第78-80页 |
| 附录4 Mgg1的DNA序列 | 第80-82页 |
| 附录5 Mgg1编码的氨基酸序列 | 第82页 |
| 附录6 Mgg1氨基酸序列的CLUSTALW多重比对 | 第82页 |
