| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-19页 |
| 1.1 7-脱氢胆甾醇的简介与研究现状 | 第10-13页 |
| 1.1.1 维生素D的概述 | 第10页 |
| 1.1.2 7-脱氢胆甾醇与维生素D_3 | 第10-11页 |
| 1.1.3 7-脱氢胆甾醇的现有合成技术 | 第11-13页 |
| 1.2 乙酰辅酶A与次级代谢产物的生物合成 | 第13-14页 |
| 1.2.1 乙酰辅酶A简介 | 第13-14页 |
| 1.2.2 提高乙酰辅酶A供应有利于次级代谢产物的合成 | 第14页 |
| 1.3 氧化还原平衡与次级代谢产物的生物合成 | 第14-17页 |
| 1.3.1 氧化还原平衡与辅因子 | 第14-15页 |
| 1.3.2 辅因子工程 | 第15页 |
| 1.3.3 辅因子再生 | 第15-16页 |
| 1.3.4 氧化还原平衡与溢流代谢 | 第16-17页 |
| 1.3.5 细胞质氧化还原状态的测定 | 第17页 |
| 1.4 本课题的主要内容 | 第17-19页 |
| 第二章 材料与方法 | 第19-37页 |
| 2.1 实验菌株 | 第19页 |
| 2.2 实验仪器 | 第19-20页 |
| 2.3 实验试剂 | 第20-21页 |
| 2.4 培养基的配置 | 第21-22页 |
| 2.5 基因元件的获得 | 第22-31页 |
| 2.5.1 外源基因元件的获得 | 第22-28页 |
| 2.5.2 内源基因元件的PCR扩增 | 第28-31页 |
| 2.6 酵母转化方法 | 第31-32页 |
| 2.7 发酵培养方法 | 第32页 |
| 2.7.1 摇瓶发酵 | 第32页 |
| 2.7.2 发酵罐发酵 | 第32页 |
| 2.8 产物提取方法 | 第32-33页 |
| 2.9 GC-TOF-MS检测方法 | 第33页 |
| 2.10 乙酰辅酶A定量方法 | 第33-34页 |
| 2.11 海藻糖定量方法 | 第34-35页 |
| 2.12 细胞总NADH/NAD~+的测定 | 第35页 |
| 2.13 胞内小分子代谢物的提取方法 | 第35-36页 |
| 2.14 胞内小分子代谢物的LC-MS检测方法 | 第36-37页 |
| 第三章 7-脱氢胆甾醇生产菌株的构建 | 第37-45页 |
| 3.1 7-脱氢胆甾醇合成模块的构建 | 第37-38页 |
| 3.1.1 人源C-24还原酶(DHCR24)表达盒的构建 | 第37页 |
| 3.1.2 酵母内源截断的HMG-CoA还原酶(tHMG1)表达盒的构建 | 第37页 |
| 3.1.3 7-脱氢胆甾醇合成模块的组装 | 第37-38页 |
| 3.2 7-脱氢胆甾醇生产菌株的构建 | 第38-43页 |
| 3.2.1 麦角固醇对7-脱氢胆甾醇合成的影响 | 第38-41页 |
| 3.2.2 合成7-脱氢胆甾醇的底盘菌株的选择 | 第41-43页 |
| 3.3 小结 | 第43-45页 |
| 第四章 乙酰辅酶A对7-脱氢胆甾醇合成的影响 | 第45-53页 |
| 4.1 乙酰辅酶A合成增强模块的构建 | 第45-47页 |
| 4.1.1 酵母内源乙醇脱氢酶(ADH2)表达盒的构建 | 第45页 |
| 4.1.2 酵母内源乙醛脱氢酶(ALD6)表达盒的构建 | 第45页 |
| 4.1.3 沙门氏菌源的乙酰辅酶A合成酶(ACS)表达盒的构建 | 第45-46页 |
| 4.1.4 鼠源的柠檬酸裂解酶(ACL)表达盒的构建 | 第46页 |
| 4.1.5 乙酰辅酶A合成增强模块的组装 | 第46-47页 |
| 4.2 乙酰辅酶A合成增强模块对7-脱氢胆甾醇合成的影响 | 第47-50页 |
| 4.2.1 含有乙酰辅酶A合成增强模块的7-脱氢胆甾醇生产菌株的构建 | 第47-48页 |
| 4.2.2 乙酰辅酶A含量变化的分析 | 第48-49页 |
| 4.2.3 含有乙酰辅酶A合成增强模块的7-脱氢胆甾醇生产菌株中产物的测定 | 第49-50页 |
| 4.3 乙酰辅酶A合成增强模块对麦角固醇合成的影响 | 第50-51页 |
| 4.3.1 含有乙酰辅酶A合成增强模块的BY4742菌株的构建 | 第50页 |
| 4.3.2 含有乙酰辅酶A合成增强模块的BY4742菌株的发酵 | 第50-51页 |
| 4.4 小结 | 第51-53页 |
| 第五章 氧化还原平衡对7-脱氢胆甾醇合成的影响 | 第53-66页 |
| 5.1 溢流代谢的发现 | 第53-57页 |
| 5.1.1 重组酵母菌株中主要副产物的积累 | 第53-54页 |
| 5.1.2 麦角固醇缺陷对重组酵母中副产物的影响 | 第54-55页 |
| 5.1.3 渗透压保护的研究 | 第55-57页 |
| 5.2 氧化还原不平衡原因的探究 | 第57-61页 |
| 5.2.1 7-脱氢胆甾醇合成路径的化学计量学计算 | 第57-58页 |
| 5.2.2 工程酵母细胞总NADH/NAD~+的测定 | 第58-59页 |
| 5.2.3 工程酵母细胞质自由NADH/NAD~+的测定 | 第59-61页 |
| 5.3 辅因子再生模块的构建 | 第61-63页 |
| 5.3.1 肺炎双链球菌源的NADH氧化酶(NOX)表达盒的构建 | 第62页 |
| 5.3.2 荚膜组织胞浆菌源的选择性氧化酶(AOX1)表达盒的构建 | 第62页 |
| 5.3.3 辅因子再生模块的组装 | 第62-63页 |
| 5.4 辅因子再生模块对7-脱氢胆甾醇合成的影响 | 第63-64页 |
| 5.5 7-脱氢胆甾醇的发酵优化 | 第64-65页 |
| 5.6 小结 | 第65-66页 |
| 第六章 结论与展望 | 第66-69页 |
| 6.1 结论 | 第66-67页 |
| 6.2 展望 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-76页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
