| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 木聚糖酶 | 第9-11页 |
| 1.1.1 木聚糖简介 | 第9页 |
| 1.1.2 木聚糖酶简介 | 第9-10页 |
| 1.1.3 木聚糖酶的应用 | 第10页 |
| 1.1.4 木聚糖酶的制备 | 第10-11页 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统简介 | 第11-15页 |
| 1.2.1 毕赤酵母的甲醇代谢途径 | 第11-12页 |
| 1.2.2 毕赤酵母启动子 | 第12页 |
| 1.2.3 毕赤酵母菌株及载体 | 第12-13页 |
| 1.2.4 外源基因的整合及多拷贝插入 | 第13页 |
| 1.2.5 毕赤酵母表达的影响因素 | 第13-14页 |
| 1.2.6 毕赤酵母高密度发酵策略 | 第14-15页 |
| 1.3 毕赤酵母自主复制序列的简介 | 第15-16页 |
| 1.4 立题依据及意义 | 第16页 |
| 1.5 本论文主要研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-26页 |
| 2.1 材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第18-19页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第19页 |
| 2.1.4 培养基与常用溶液 | 第19-20页 |
| 2.2 基因工程操作方法 | 第20-23页 |
| 2.2.1 PCR扩增木聚糖酶基因 | 第20页 |
| 2.2.2 PARS1及PARS2的基因克隆 | 第20-21页 |
| 2.2.3 大肠杆菌E.coliJM109感受态制备及转化 | 第21页 |
| 2.2.4 大肠杆菌质粒提取 | 第21页 |
| 2.2.5 PAOX1-PARS及PGAP-PARS游离表达载体构建 | 第21-22页 |
| 2.2.6 重组表达载体PAOX1-PARS-xynA及PGAP-PARS-xynA构建及鉴定 | 第22页 |
| 2.2.7 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| 2.2.8 游离型重组菌的构建与筛选 | 第23页 |
| 2.2.9 强化型重组菌的构建与筛选 | 第23页 |
| 2.3 发酵方法 | 第23-24页 |
| 2.3.1 摇瓶发酵 | 第23-24页 |
| 2.3.2 重组菌3.6L罐发酵 | 第24页 |
| 2.4 分析方法 | 第24-25页 |
| 2.4.1 生物量的测定 | 第24页 |
| 2.4.2 木聚糖酶酶活测定 | 第24页 |
| 2.4.3 蛋白质浓度的测定 | 第24页 |
| 2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第24-25页 |
| 2.5 重组木聚糖酶XynA的纯化 | 第25-26页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第26-48页 |
| 3.1 PARS游离载体的构建 | 第26-29页 |
| 3.1.1 PARS1重组游离表达载体的构建 | 第26-28页 |
| 3.1.2 PARS2重组游离表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 3.2 不同启动子调控下游离型木聚糖酶重组毕氏酵母的构建及表达 | 第29-31页 |
| 3.2.1 游离型重组质粒的构建 | 第29-30页 |
| 3.2.2 游离型毕赤酵母表达木聚糖酶重组菌的构建与筛选 | 第30-31页 |
| 3.3 游离型重组菌的3.6L罐高密度发酵 | 第31-38页 |
| 3.3.1 表达载体pGAPZαA-PARS2-xynA、pGAPZαA-xynA的构建及菌株筛选 | 第31-33页 |
| 3.3.2 P.pastorisKM71/pGAPZαA-PARS2-xynA3.6L罐营养性参数发酵优化 | 第33-36页 |
| 3.3.3 游离型重组菌与整合型重组菌上罐发酵对比 | 第36-38页 |
| 3.4 强化型木聚糖酶重组毕氏酵母的构建、表达、酶学性质研究 | 第38-42页 |
| 3.4.1 强化型重组菌的构建及筛选 | 第38-40页 |
| 3.4.2 强化型重组木聚糖酶的纯化 | 第40页 |
| 3.4.3 重组木聚糖酶的最适温度及温度稳定性 | 第40-41页 |
| 3.4.4 重组木聚糖酶的最适pH及pH稳定性 | 第41页 |
| 3.4.5 金属离子对重组木聚糖酶的影响 | 第41-42页 |
| 3.5 强化型重组菌的3.6L罐高密度发酵 | 第42-48页 |
| 3.5.1 诱导温度对XynA产量的影响 | 第42-43页 |
| 3.5.2 初始诱导细胞浓度对XynA产量的影响 | 第43-45页 |
| 3.5.3 诱导阶段维持甲醇浓度对XynA产量的影响 | 第45-46页 |
| 3.5.4 强化型重组菌与整合型重组菌发酵对比 | 第46-48页 |
| 主要结论与展望 | 第48-50页 |
| 主要结论 | 第48页 |
| 展望 | 第48-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-58页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第58页 |
