| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-24页 |
| 1．1 啤酒及啤酒的功能性 | 第10-11页 |
| 1．2 啤酒风味老化及预防措施 | 第11-12页 |
| 1．3 啤酒中亚硫酸盐保持啤酒稳定的作用机制及其来源 | 第12页 |
| 1．4 酿酒酵母的亚硫酸盐代谢途径 | 第12-13页 |
| 1．5 酿酒酵母的选育及改良 | 第13-16页 |
| 1．5．1 酿酒酵母的研究动态 | 第13-14页 |
| 1．5．2 酿酒酵母的选育 | 第14-16页 |
| 1．6 标记基因的应用及剔除 | 第16-21页 |
| 1．6．1 标记基因的利用 | 第16页 |
| 1．6．2 标记基因对受体细胞影响及安全问题 | 第16-17页 |
| 1．6．3 标记基因的剔除 | 第17-21页 |
| 1．7 酿酒酵母的遗传转化系统 | 第21-22页 |
| 1．7．1 酿酒酵母的筛选标记 | 第21页 |
| 1．7．2 酿酒酵母转化方法 | 第21-22页 |
| 1．8 基因敲除 | 第22-23页 |
| 1．8．1 基因打靶 | 第22页 |
| 1．8．2 基因敲除 | 第22-23页 |
| 1．9 本论文研究的目的及意义 | 第23-24页 |
| 第二章 酿酒酵母高效转化体系的建立 | 第24-33页 |
| 2．1 材料与方法 | 第24-30页 |
| 2．1．1 实验中所使用质粒及菌株 | 第24页 |
| 2．1．2 试剂与设备 | 第24-25页 |
| 2．1．3 溶液配置 | 第25-26页 |
| 2．1．4 培养基 | 第26-27页 |
| 2．1．5 CaCl_2法转化大肠杆菌DH5α | 第27页 |
| 2．1．6 质粒的提取 | 第27-28页 |
| 2．1．7 DH5α转化子的筛选 | 第28页 |
| 2．1．8 琼脂糖凝胶电泳 | 第28页 |
| 2．1．9 胶纯化 DNA | 第28页 |
| 2．1．10 酿酒酵母 H158感受态的制备 | 第28-29页 |
| 2．1．11 PEG/ LiAc/ssDNA转化感受态酿酒酵母 | 第29页 |
| 2．1．12 酵母质粒的提取 | 第29-30页 |
| 2．2 结果与讨论 | 第30-32页 |
| 2．2．1 CaCl_2法转化大肠杆菌DH5α | 第30页 |
| 2．2．2 DH5α转化子质粒的提取 | 第30页 |
| 2．2．3 酿酒酵母转化子验证 | 第30页 |
| 2．2．4 PEG/LiAc/ssDNA转化效率的探索 | 第30-32页 |
| 2．2．4．1 热激时间的影响 | 第30-31页 |
| 2．2．4．2 单链鱼精 DNA的影响 | 第31页 |
| 2．2．4．3 DMSO的影响 | 第31-32页 |
| 2．3 本章小结 | 第32-33页 |
| 第三章 外源基因的构建及转化子的筛选 | 第33-48页 |
| 3．1 材料与方法 | 第34-40页 |
| 3．1．1 质粒及菌株 | 第34页 |
| 3．1．2 试剂及培养基 | 第34-35页 |
| 3．1．3 工业酿酒酵母 G418抗性验证 | 第35页 |
| 3．1．4 PCR反应系统 | 第35-36页 |
| 3．1．5 SFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证 | 第36-39页 |
| 3．1．5．1 引物设计 | 第36页 |
| 3．1．5．2 第一轮 PCR扩增 | 第36页 |
| 3．1．5．3 第二轮 PCR扩增 | 第36页 |
| 3．1．5．4 胶纯化 DNA | 第36页 |
| 3．1．5．5 PCR产物直接转化工业酿酒酵母 | 第36-37页 |
| 3．1．5．6 酵母转化子的筛选 | 第37页 |
| 3．1．5．7 酵母染色体提取 | 第37-38页 |
| 3．1．5．8 转化子验证 | 第38页 |
| 3．1．5．9 酿酒酵母生孢 | 第38页 |
| 3．1．5．10 同源序列比对 | 第38-39页 |
| 3．1．6 LFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证 | 第39-40页 |
| 3．1．6．1 引物设计 | 第39页 |
| 3．1．6．2 酵母染色体同源序列的克隆(第一轮 PCR) | 第39页 |
| 3．1．6．3 G418抗性基因的克隆(第二轮 PCR) | 第39-40页 |
| 3．1．6．4 增产物纯化、酵母转化及转化子验证 | 第40页 |
| 3．1．6．5 转化子稳定性验证 | 第40页 |
| 3．2 结果与讨论 | 第40-46页 |
| 3．2．1 工业酿酒酵母的 G418抗性验证 | 第40页 |
| 3．2．2 SFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证 | 第40-42页 |
| 3．2．2．1 第一轮 PCR扩增 | 第40-41页 |
| 3．2．2．2 第二轮 PCR扩增 | 第41-42页 |
| 3．2．3 转化子验证 | 第42页 |
| 3．2．4 酵母生孢试验及序列比对结果 | 第42页 |
| 3．2．5 转化子稳定性验证 | 第42-43页 |
| 3．2．6 LFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证 | 第43-45页 |
| 3．2．6．1 met10同源序列的克隆结果 | 第43-44页 |
| 3．2．6．2 G418抗性基因的克隆 | 第44-45页 |
| 3．2．7 LFH-PCR产物的纯化及转化 | 第45页 |
| 3．2．8 酿酒酵母转化子筛选及验证 | 第45页 |
| 3．2．9 转化子稳定性验证 | 第45-46页 |
| 3．2．10 基因序列测序 | 第46页 |
| 3．3 本章小结 | 第46-48页 |
| 第四章 基因敲除菌株生长及发酵性状测定 | 第48-61页 |
| 4．1 实验室摇瓶试验 | 第48-52页 |
| 4．1．1 材料与方法 | 第48-49页 |
| 4．1．1．1 试剂与培养基 | 第48-49页 |
| 4．1．1．2 亚硫酸盐含量测定的标准曲线的制作 | 第49页 |
| 4．1．1．3 发酵液中亚硫酸盐含量测定 | 第49页 |
| 4．1．1．4 酵母产 H_2S能力的测定 | 第49页 |
| 4．1．2 结果与讨论 | 第49-52页 |
| 4．1．2．1 met10基因敲除菌株与原始菌株在的生长性能测定 | 第49-51页 |
| 4．1．2．2 麦汁发酵中亚硫酸盐含量的测定 | 第51-52页 |
| 4．1．2．3 敲除菌株与原始菌株产 H_2S能力的测定 | 第52页 |
| 4．2 1000L发酵罐发酵试验 | 第52-59页 |
| 4．2．1 材料与方法 | 第52-54页 |
| 4．2．1．1 试剂与仪器 | 第52页 |
| 4．2．1．2 酵母扩大培养 | 第52-53页 |
| 4．2．1．3 发酵工艺 | 第53页 |
| 4．2．1．4 发酵过程发酵液中亚硫酸盐含量测定 | 第53页 |
| 4．2．1．5 发酵液中醛、酯及高级醇等物质的检测 | 第53-54页 |
| 4．2．2 结果与讨论 | 第54-59页 |
| 4．2．2．1 原始菌株与敲除菌株扩培及发酵特性 | 第54-55页 |
| 4．2．2．2 发酵液中亚硫酸盐含量测定 | 第55-56页 |
| 4．2．2．3 两株菌株发酵性能的比较 | 第56页 |
| 4．2．2．4 气相色谱仪分析啤酒中醛、酯及高级醇含量 | 第56-58页 |
| 4．2．2．5 两种发酵液口感的鉴定 | 第58-59页 |
| 4．3 100吨啤酒发酵罐储存试验及啤酒风味稳定的研究 | 第59-60页 |
| 4．3．1 啤酒的瓶装 | 第59页 |
| 4．3．2 瓶装啤酒口感品尝 | 第59页 |
| 4．3．3 瓶装啤酒风味物质检测 | 第59-60页 |
| 4．4 本章小结 | 第60-61页 |
| 第五章 酿酒酵母染色体上 G418抗性基因的剔除 | 第61-62页 |
| 全文总结 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
