| 中文摘要 | 第1-16页 |
| 英文摘要 | 第16-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-44页 |
| 1 防御素 | 第19-27页 |
| 2 甜蛋白 | 第27-32页 |
| 3 pET表达系统 | 第32-35页 |
| 4 甲醇酵母表达系统 | 第35-44页 |
| 第二章 人β防御素3基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的克隆表达 | 第44-61页 |
| 1 材料与方法 | 第44-54页 |
| 1．1 实验材料 | 第44-45页 |
| 1．2 实验方法 | 第45-54页 |
| 1．2．1 hBD_3基因的设计合成 | 第45-46页 |
| 1．2．2 基因的连接和PCR反应 | 第46页 |
| 1．2．3 琼脂糖凝胶电泳 | 第46页 |
| 1．2．4 PCR产物的纯化和回收 | 第46-47页 |
| 1．2．5 感受态细胞的制备及转化 | 第47页 |
| 1．2．6 PCR产物的克隆 | 第47页 |
| 1．2．7 质粒的提取 | 第47-48页 |
| 1．2．8 重组质粒pUCmT-hBD_3的筛选和鉴定 | 第48-49页 |
| 1．2．9 表达载体pET-hBD_3的构建 | 第49页 |
| 1．2．10 表达载体pET-hBD_3的筛选和鉴定 | 第49-50页 |
| 1．2．11 SDS-PAGE电泳 | 第50-52页 |
| 1．2．12 β防御素3的诱导表达及电泳检测 | 第52页 |
| 1．2．13 融合蛋白的提取和纯化 | 第52-53页 |
| 1．2．14 蛋白浓度的检测 | 第53-54页 |
| 1．2．15 重组天然蛋白的获取与纯化 | 第54页 |
| 1．2．17 防御素蛋白的抑菌活性检测 | 第54页 |
| 2 结果 | 第54-59页 |
| 2．1 hBD_3基因的构建 | 第54页 |
| 2．2 重组质粒pUCmT-hBb_3的鉴定 | 第54-55页 |
| 2．3 重组表达载体pET-hBD_3的鉴定 | 第55-56页 |
| 2．4 目的基因的表达与检测 | 第56页 |
| 2．5 目的蛋白的纯化 | 第56-58页 |
| 2．6 防御素蛋白的活性检测 | 第58-59页 |
| 3 讨论 | 第59-61页 |
| 第三章 植物des-pGlu1-Brazzein基因表达载体的构建及其在大肠杆菌中的克隆表达 | 第61-70页 |
| 1 材料与方法 | 第61-64页 |
| 1．1 实验材料 | 第61-62页 |
| 1．2 实验方法 | 第62-64页 |
| 1．2．1 甜蛋白基因的设计合成 | 第62页 |
| 1．2．2 基因的连接和PCR反应 | 第62页 |
| 1．2．3 PCR产物的纯化和回收 | 第62页 |
| 1．2．4 PCR产物的克隆 | 第62-63页 |
| 1．2．5 重组质粒pUCmT-Bra的筛选和鉴定 | 第63页 |
| 1．2．6 表达载体pET-Bra的构建 | 第63页 |
| 1．2．7 表达载体pET-Bra的筛选和鉴定 | 第63-64页 |
| 1．2．8 des-pGlu1-Brazzein基因的诱导表达及电泳检测 | 第64页 |
| 1．2．9 des-pGlul-Brazzein融合蛋白与天然蛋白的获取与蛋白浓度检测 | 第64页 |
| 1．2．10 目的蛋白活性的检测 | 第64页 |
| 2 结果 | 第64-68页 |
| 2．1 des-pGlu1-Bra基因的构建 | 第64页 |
| 2．2 重组载体pUCmT-Bra的鉴定 | 第64-65页 |
| 2．3 表达载体pET-Bra的鉴定 | 第65-67页 |
| 2．4 目的基因的表达与检测 | 第67页 |
| 2．5 目的蛋白的纯化 | 第67-68页 |
| 2．6 des-pGlu1-Brazzein的甜度测定 | 第68页 |
| 3 讨论 | 第68-70页 |
| 第四章 人β防御素3与植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达 | 第70-78页 |
| 1 材料与方法 | 第70-72页 |
| 1．1 实验材料 | 第70-71页 |
| 1．2 实验方法 | 第71-72页 |
| 1．2．1 hBD_3和des-pGlu1—Brazzein基因的合成 | 第71页 |
| 1．2．2 嵌合基因hBD_3-Bra的构建 | 第71页 |
| 1．2．3 PCR产物的纯化和回收 | 第71页 |
| 1．2．4 PCR产物的克隆 | 第71页 |
| 1．2．5重组质粒pUCmT-hBD_(3)-Bra的筛选和鉴定 | 第71-72页 |
| 1．2．6 表达载体pET-hBD_3-Bra的构建 | 第72页 |
| 1．2．7 表达载体pET-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 | 第72页 |
| 1．2．8 hBD_3-Bra嵌合基因的诱导表达及电泳检测 | 第72页 |
| 1．2．9 hBD_3-Bra嵌合蛋白的获取与蛋白浓度检测 | 第72页 |
| 1．2．10 hBD_3和des-pGlu1-Brazzein的获取 | 第72页 |
| 1．2．11 目的蛋白的活性检测 | 第72页 |
| 2 结果 | 第72-77页 |
| 2．1 嵌合基因hBD_3-Bra的构建 | 第72-73页 |
| 2．2 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的鉴定 | 第73页 |
| 2．3 表达载体pET-hBD_3-Bra的鉴定 | 第73-74页 |
| 2．4 嵌合基因hBD_3-Bra的重组表达与检测 | 第74-75页 |
| 2．5 目的蛋白的纯化 | 第75-77页 |
| 2．6 目的蛋白的活性检测 | 第77页 |
| 3 讨论 | 第77-78页 |
| 第五章 BL21-pET—hBD_3的摇瓶发酵工艺研究 | 第78-104页 |
| 1 材料与方法 | 第78-80页 |
| 1．1 菌株与培养基 | 第78页 |
| 1．2 实验方法 | 第78-80页 |
| 1．2．1 菌种活化 | 第78页 |
| 1．2．2 装液量、接种量和初始pH值的选择 | 第78-79页 |
| 1．2．3 IPTG诱导BL21-pET-hBD_3表达目的蛋白的条件选择 | 第79页 |
| 1．2．4 乳糖诱导BL21-pET-hBD_3表达目的蛋白的条件选择 | 第79-80页 |
| 1．2．5 诱导温度的选择 | 第80页 |
| 1．2．6 菌株BL21-pET-hBD_3的生物量测定 | 第80页 |
| 1．2．7 诱导BL21-pET-hBD_3表达目的产物的最佳条件分析 | 第80页 |
| 2 结果 | 第80-103页 |
| 2．1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定 | 第80-83页 |
| 2．2 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果 | 第83-91页 |
| 2．2．1 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 | 第83-85页 |
| 2．2．2 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 | 第85-86页 |
| 2．2．3 BL21-pET-hBD_3以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 | 第86-88页 |
| 2．2．4 BL21-pET-hBD_3 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第88-89页 |
| 2．2．5 BL21-pET-hBD_3 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第89-91页 |
| 2．3 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果 | 第91-100页 |
| 2．3．1 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 | 第92-94页 |
| 2．3．2 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 | 第94-95页 |
| 2．3．3 BL21-pET-hBD_3以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 | 第95-97页 |
| 2．3．4 BL21-pET-hBD_3 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第97-98页 |
| 2．3．5 BL21-pET-hBD_337℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第98-100页 |
| 2．4 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果 | 第100-103页 |
| 2．4．1 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果 | 第100-101页 |
| 2．4．2 BL21-pET-hBD_3在不同温度下分别以IPTC和乳糖诱导目的蛋白表达的结果 | 第101-103页 |
| 3 讨论 | 第103-104页 |
| 第六章 BL21-pET—Bra的摇瓶发酵工艺研究 | 第104-129页 |
| 1 材料与方法 | 第104-105页 |
| 1．1 菌株与培养基 | 第104页 |
| 1．2 实验方法 | 第104-105页 |
| 1．2．1 菌种活化 | 第104页 |
| 1．2．2 装液量、接种量和初始pH值的选择 | 第104页 |
| 1．2．3 IPTG诱导BL21-pET-Bra表达目的蛋白的条件选择 | 第104-105页 |
| 1．2．4 乳糖诱导BL21-pET-Bra表达目的蛋白的条件选择 | 第105页 |
| 1．2．5 诱导温度的选择 | 第105页 |
| 1．2．6 菌株BL21-pET-Bra的生物量测定 | 第105页 |
| 1．2．7 诱导BL21-pET-Bra表达目的产物的最佳条件分析 | 第105页 |
| 2 结果 | 第105-128页 |
| 2．1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定 | 第105-108页 |
| 2．2 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果 | 第108-117页 |
| 2．2．1 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 | 第108-110页 |
| 2．2．2 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 | 第110-112页 |
| 2．2．3 BL21-pET-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 | 第112-114页 |
| 2．2．4 BL21-pET-Bra 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第114-115页 |
| 2．2．5 BL21-pET-Bra 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第115-117页 |
| 2．3 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果 | 第117-125页 |
| 2．3．1 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 | 第117-119页 |
| 2．3．2 BL21-pET-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 | 第119-120页 |
| 2．3．3 BL21-pET-Bras以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 | 第120-121页 |
| 2．3．4 BL21-pET-Bra 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第121-123页 |
| 2．3．5 BL21-pET-Bra 37℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第123-125页 |
| 2．4 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果 | 第125-128页 |
| 2．4．1 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果 | 第125-126页 |
| 2．4．2 BL21-pET-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达的结果 | 第126-128页 |
| 3 讨论 | 第128-129页 |
| 第七章 BL21-pET—hBD_3-Bra摇瓶发酵工艺研究 | 第129-154页 |
| 1 材料与方法 | 第129-130页 |
| 1．1 菌株与培养基 | 第129页 |
| 1．2 实验方法 | 第129-130页 |
| 1．2．1 菌种活化 | 第129页 |
| 1．2．2 装液量、接种量和初始pH值的选择 | 第129页 |
| 1．2．3 IPTG诱导BL21-pET—hBD_3-Bra表达目的蛋白的条件选择 | 第129页 |
| 1．2．4 乳糖诱导BL21-pET-hBD_3-Bra表达目的蛋白的条件选择 | 第129-130页 |
| 1．2．5 诱导温度的选择 | 第130页 |
| 1．2．6 菌株BL21-pET-hBD_3-Bra的生物量测定 | 第130页 |
| 1．2．7 诱导BL21-pET-hBD_3-Bra表达目的产物的最佳条件分析 | 第130页 |
| 2 结果 | 第130-152页 |
| 2．1 最佳装液量、接种量和初始pH的确定 | 第130-133页 |
| 2．2 BL21-pFr-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间的结果 | 第133-141页 |
| 2．2．1 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 | 第133-135页 |
| 2．2．2 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 | 第135-136页 |
| 2．2．3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同IPTG浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 | 第136-138页 |
| 2．2．4 BL21-pET-hBD_3-Bra 30℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第138-139页 |
| 2．2．5 BL21-pET-hBD_3-Bra 37℃时以不同IPTG浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第139-141页 |
| 2．3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间的结果 | 第141-150页 |
| 2．3．1 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导不同时间所获得生物量的结果 | 第141-143页 |
| 2．3．2 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导4h时目的蛋白表达的结果 | 第143-145页 |
| 2．3．3 BL21-pET-hBD_3-Bra以不同乳糖浓度和温度诱导6h时目的蛋白表达的结果 | 第145-146页 |
| 2．3．4 BL21-pET-hBD_3-Bra 30℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第146-148页 |
| 2．3．5 BL21-pET-hBD_3-Bra 37℃时以不同乳糖浓度诱导不同时间目的蛋白表达的结果 | 第148-150页 |
| 2．4 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导的结果 | 第150-152页 |
| 2．4．1 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导所获得生物量的结果 | 第150-151页 |
| 2．4．2 BL21-pET-hBD_3-Bra在不同温度下分别以IPTG和乳糖诱导目的蛋白表达的结果 | 第151-152页 |
| 3 讨论 | 第152-154页 |
| 第八章 人β防御素3真核表达载体的构建 | 第154-162页 |
| 1 材料与方法 | 第154-159页 |
| 1．1 实验材料 | 第154-155页 |
| 1．2 实验方法 | 第155-159页 |
| 1．2．1 hBD-3基因的合成 | 第155页 |
| 1．2．2 基因的连接和PCR反应 | 第155-156页 |
| 1．2．3 PCR产物的纯化和回收 | 第156页 |
| 1．2．4 基因的克隆 | 第156页 |
| 1．2．5 重组质粒pUCmT-hBD_3的筛选和鉴定 | 第156页 |
| 1．2．6 表达载体pPIC9K-hBD_3的构建 | 第156-157页 |
| 1．2．7 表达载pPIC9K-hBD_3的筛选和鉴定 | 第157-158页 |
| 1．2．8 pPIC9K-hBD_3质粒的线性化 | 第158页 |
| 1．2．9 酵母感受态细胞的制备和转化 | 第158页 |
| 1．2．10 整合转化子的筛选 | 第158-159页 |
| 1．2．11 GS115-pPIC9K-hBD_3的PCR鉴定 | 第159页 |
| 2 结果 | 第159-161页 |
| 2．1 hBD_3基因的构建 | 第159页 |
| 2．2 重组质粒pUCmT-hBD_3的鉴定 | 第159-160页 |
| 2．3 表达载体pPIC9K-hBD_3的鉴定 | 第160-161页 |
| 3 讨论 | 第161-162页 |
| 第九章 植物des-pGlul-Brazzein基因真核表达载体的构建及其在甲醇酵母中的表达 | 第162-170页 |
| 1 材料与方法 | 第162-166页 |
| 1．1 实验材料 | 第162页 |
| 1．2 实验方法 | 第162-166页 |
| 1．2．1 甜蛋白基因的设计合成 | 第162-163页 |
| 1．2．2 基因的连接和PCR反应 | 第163页 |
| 1．2．3 PCR产物的纯化和回收 | 第163页 |
| 1．2．4 PCR产物的克隆 | 第163-164页 |
| 1．2．5 重组质粒pUCmT-Bra的筛选和鉴定 | 第164页 |
| 1．2．6 表达载体pPIC9K-Bra的构建 | 第164页 |
| 1．2．7 表达载pPIC9K-Bra的筛选和鉴定 | 第164页 |
| 1．2．8 pPIC9K-Bra质粒的线性化 | 第164-165页 |
| 1．2．9 酵母感受态细胞的制备、转化及整合转化子的筛选 | 第165页 |
| 1．2．10 GS115-pPIC9K-Bra的PCR鉴定 | 第165页 |
| 1．2．11 GSIl5-pPIC9K-Bra的诱导表达 | 第165-166页 |
| 1．2．12 表达产物分析 | 第166页 |
| 2 结果 | 第166-169页 |
| 2．1 des-pGlul-Brazzein的基因合成 | 第166页 |
| 2．2 重组质粒pUCmT-Bra的鉴定 | 第166页 |
| 2．3 表达载体pPIC9K-Bra的鉴定 | 第166-167页 |
| 2．4 GS115-pPIC9K-Bra的筛选和鉴定 | 第167-168页 |
| 2．5 GS115-pPIC9K-Bra的诱导表达 | 第168-169页 |
| 3 讨论 | 第169-170页 |
| 第十章 人β防御素3与植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的合成及其在甲醇酵母中的表达 | 第170-176页 |
| 1 材料与方法 | 第170-172页 |
| 1．1 实验材料 | 第170页 |
| 1．2 实验方法 | 第170-172页 |
| 1．2．1 hBD_3和des-pGlu1-Bra基因的合成 | 第170-171页 |
| 1．2．2 基因的连接和PCR反应 | 第171页 |
| 1．2．3 PCR产物的纯化和回收 | 第171页 |
| 1．2．4 PCR产物的克隆 | 第171页 |
| 1．2．5 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 | 第171页 |
| 1．2．6 表达载体pPIC9K-hBb_3-Bra的构建 | 第171-172页 |
| 1．2．7 表达载体pPIC9K-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 | 第172页 |
| 1．2．8 pPIC9K-hBD_3-Bra质粒的线性化 | 第172页 |
| 1．2．9 酵母感受态细胞的制备、转化及整合转化子的筛选 | 第172页 |
| 1．2．10 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的PCR鉴定 | 第172页 |
| 1．2．11 GS115-pPIC9K—hBD_3-Bra的诱导表达 | 第172页 |
| 1．2．12 表达产物分析 | 第172页 |
| 2 结果 | 第172-175页 |
| 2．1 hBD_3-Bra基因合成 | 第172-173页 |
| 2．2 重组质粒pUCmT-hBD_3-Bra的鉴定 | 第173页 |
| 2．3 表达载体pPIC9K-hBD_3-Bra的鉴定 | 第173-174页 |
| 2．4 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的筛选和鉴定 | 第174-175页 |
| 2．5 GS115-pPIC9K-hBD_3-Bra的诱导表达 | 第175页 |
| 3 讨论 | 第175-176页 |
| 结论及后续研究展望 | 第176-180页 |
| 参考文献 | 第180-193页 |
| 致谢 | 第193-194页 |
| 个人简历及攻读博士学位期间发表的论文 | 第194页 |
