| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-25页 |
| 1.1 乙偶姻的理化性质 | 第12页 |
| 1.2 乙偶姻的应用 | 第12-13页 |
| 1.2.1 在食品领域中的应用 | 第12-13页 |
| 1.2.2 在医药领域中的用途 | 第13页 |
| 1.2.3 在烟草制品中的应用 | 第13页 |
| 1.2.4 乙偶姻的其他用途 | 第13页 |
| 1.3 偶姻的生产方法 | 第13-17页 |
| 1.3.1 化学合成法 | 第13-14页 |
| 1.3.2 生物催化法 | 第14页 |
| 1.3.3 微生物发酵法 | 第14-17页 |
| 1.3.3.1 乙偶姻生产菌株 | 第14页 |
| 1.3.3.2 乙偶姻生产代谢途径 | 第14-15页 |
| 1.3.3.3 乙偶姻在体内的分解代谢 | 第15页 |
| 1.3.3.4 乙偶姻在体内的代谢调控机制 | 第15-17页 |
| 1.3.3.5 乙偶姻在微生物体内代谢的生理意义 | 第17页 |
| 1.4 提高微生物生产乙偶姻产量的策略 | 第17-23页 |
| 1.4.1 诱变育种 | 第17-18页 |
| 1.4.2 提高乙偶姻前体物质丙酮酸的积累 | 第18-19页 |
| 1.4.3 强化乙偶姻合成途径的关键酶 | 第19-20页 |
| 1.4.4 降低乙偶姻的进一步代谢 | 第20-21页 |
| 1.4.5 辅酶调控策略 | 第21-22页 |
| 1.4.6 发酵调控策略 | 第22-23页 |
| 1.5 光学纯乙偶姻的生产策略 | 第23-24页 |
| 1.6 本课题的研究意义和内容 | 第24-25页 |
| 1.6.1 本课题的研究意义 | 第24页 |
| 1.6.2 本课题的研究内容 | 第24-25页 |
| 第二章 (3R)-乙偶姻生产菌株的构建 | 第25-43页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 材料和方法 | 第25-36页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和引物 | 第25-26页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第26-27页 |
| 2.2.3 实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.2.4 培养基以及抗生素的配置 | 第28-29页 |
| 2.2.5 基因组DNA的提取 | 第29页 |
| 2.2.6 质粒DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.7 切胶回收DNA | 第30页 |
| 2.2.8 DNA样品的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 2.2.10 转化 | 第31-32页 |
| 2.2.11 PCR扩增slaC和gldA基因上下游同源臂 | 第32-33页 |
| 2.2.12 slaC基因和gldA基因上下游同源臂的融合PCR | 第33页 |
| 2.2.13 自杀载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.14 结合转移 | 第34页 |
| 2.2.15 敲除菌的鉴定 | 第34-35页 |
| 2.2.16 粘质沙雷氏菌的摇瓶发酵 | 第35页 |
| 2.2.17 菌浓的测定 | 第35页 |
| 2.2.18 发酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇浓度的检测 | 第35页 |
| 2.2.19 建立乙偶姻和2,3-丁二醇的标准曲线 | 第35-36页 |
| 2.2.20 测定发酵液中蔗糖含量 | 第36页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第36-42页 |
| 2.3.1 基因组DNA的提取 | 第36页 |
| 2.3.2 slaC基因和gldA基因上下游同源臂的扩增 | 第36-37页 |
| 2.3.3 自杀载体pUT-slaC和pUT-gldA的构建及验证 | 第37-38页 |
| 2.3.4 slaC和gldA单交换菌和敲除菌的鉴定 | 第38-40页 |
| 2.3.5 乙偶姻和2,3-丁二醇的标准曲线 | 第40-41页 |
| 2.3.6 MG1及各敲除菌株的发酵结果对比 | 第41-42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 过表达转录调控蛋白SlaR提高(3R)-乙偶姻的产量 | 第43-53页 |
| 3.1 引言 | 第43页 |
| 3.2 材料与方法 | 第43-46页 |
| 3.2.1 实验试剂 | 第43页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第43页 |
| 3.2.3 菌株、质粒和引物 | 第43-44页 |
| 3.2.4 基因序列的扩增 | 第44页 |
| 3.2.5 表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 3.2.6 表达质粒的鉴定 | 第45页 |
| 3.2.7 MG14电转化感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 3.2.8 电转化 | 第45页 |
| 3.2.9 重组菌株的验证 | 第45页 |
| 3.2.10 重组菌株的发酵培养 | 第45-46页 |
| 3.2.11 SDS-PAGE检测SlaR蛋白的表达 | 第46页 |
| 3.2.12 α-ALS和α-ALDC综合酶活的测定 | 第46页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第46-52页 |
| 3.3.1 slaR基因和启动子序列的扩增及融合PCR | 第46-47页 |
| 3.3.2 表达载体pACP_C-slaR,pACP_A-slaR和pACP_R-slaR的构建及验证 | 第47-48页 |
| 3.3.3 SlaR过表达菌株的筛选及验证 | 第48-49页 |
| 3.3.4 过表达SlaR对α-ALS和α-ALDC综合酶活的影响 | 第49页 |
| 3.3.5 工程菌株和对照菌的发酵 | 第49-52页 |
| 3.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 工程菌株MG15的发酵性能优化 | 第53-63页 |
| 4.1 引言 | 第53页 |
| 4.2 材料与方法 | 第53-54页 |
| 4.2.1 实验试剂和实验仪器 | 第53页 |
| 4.2.2 发酵方法 | 第53页 |
| 4.2.3 温度对菌体生长和(3R)-乙偶姻生产的影响 | 第53页 |
| 4.2.4 装液量对菌体生长和(3R)-乙偶姻生产的影响 | 第53页 |
| 4.2.5 初始pH对菌体生长和(3R)-乙偶姻生产的影响 | 第53页 |
| 4.2.6 接种量对菌体生长和发酵的影响 | 第53-54页 |
| 4.2.7 PB设计(Plackett-Burman Design) | 第54页 |
| 4.2.8 响应面分析(Response Surface Methodology) | 第54页 |
| 4.2.9 最优化培养基的验证实验 | 第54页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第54-62页 |
| 4.3.1 培养温度对(3R)-乙偶姻产量的影响 | 第54-55页 |
| 4.3.2 装液量对(3R)-乙偶姻产量的影响 | 第55-56页 |
| 4.3.3 初始pH对(3R)-乙偶姻生产的影响 | 第56-57页 |
| 4.3.4 接种量对(3R)-乙偶姻生产的影响 | 第57-58页 |
| 4.3.5 PB实验设计优化培养基成分 | 第58-60页 |
| 4.3.6 响应面分析法优化培养基 | 第60-61页 |
| 4.3.7 优化后培养基的发酵验证 | 第61-62页 |
| 4.4 本章小结 | 第62-63页 |
| 第五章 总结与展望 | 第63-65页 |
| 5.1 总结 | 第63页 |
| 5.2 展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
