| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-21页 |
| 1.1 聚酮化合物及其生物合成 | 第12-14页 |
| 1.1.1 聚酮化合物 | 第12页 |
| 1.1.2 聚酮合酶(PKS) | 第12-14页 |
| 1.2 桔霉素的生物合成 | 第14-15页 |
| 1.3 桔霉素的稳定性研究 | 第15-16页 |
| 1.4 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase) | 第16-18页 |
| 1.5 聚酮异源合成及意义 | 第18页 |
| 1.5.1 异源合成聚酮化合物的必要性及优势 | 第18页 |
| 1.5.2 异源合成聚酮化合物的难点 | 第18页 |
| 1.6 毕赤酵母表达系统 | 第18-20页 |
| 1.6.1 毕赤酵母表达系统的优点 | 第19页 |
| 1.6.2 基因整合 | 第19页 |
| 1.6.3 酵母转化 | 第19-20页 |
| 1.7 本课题的研究背景、创新点及课题意义 | 第20-21页 |
| 第2章 桔霉素合成基因簇内功能基因的克隆及质粒构建 | 第21-30页 |
| 2.1 前言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料及方法 | 第21-24页 |
| 2.2.1 实验菌株与质粒 | 第21页 |
| 2.2.2 培养基与培养条件 | 第21页 |
| 2.2.3 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第21-22页 |
| 2.2.4 缓冲液 | 第22页 |
| 2.2.5 紫红曲霉基因组的抽提 | 第22页 |
| 2.2.6 引物设计及PCR程序 | 第22-23页 |
| 2.2.7 胶回收 | 第23页 |
| 2.2.8 目的片段克隆至毕赤酵母表达载体 | 第23页 |
| 2.2.9 大肠杆菌TOP10感受态制备及转化 | 第23-24页 |
| 2.2.10 测序验证 | 第24页 |
| 2.2.11 质粒抽提 | 第24页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第24-29页 |
| 2.3.1 orf1基因的获得及载体pPICZA-orf1的构建 | 第24-25页 |
| 2.3.2 orf2基因的获得及载体pPICZA-orf2的构建 | 第25页 |
| 2.3.3 orf3基因的获得及载体pPIC3.5K-orf3的构建 | 第25-26页 |
| 2.3.4 orf4基因的获得及载体pPIC3.5K-orf4的构建 | 第26页 |
| 2.3.5 pksCT基因的获得及载体pPICZB-pksCT的构建 | 第26-27页 |
| 2.3.6 orf5基因的获得及载体pPIC3.5K-orf5的构建 | 第27-29页 |
| 2.4 本章小结 | 第29-30页 |
| 第3章 PKSCT表达菌株的构建及产物鉴定 | 第30-43页 |
| 3.1 前言 | 第30页 |
| 3.2 实验材料及方法 | 第30-33页 |
| 3.2.1 实验菌株与质粒 | 第30页 |
| 3.2.2 培养基与培养条件 | 第30-31页 |
| 3.2.3 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第31页 |
| 3.2.4 引物设计 | 第31页 |
| 3.2.5 毕赤酵母感受态制备及电穿孔转化 | 第31-32页 |
| 3.2.6 毕赤酵母菌株在MM培养基中的诱导表达 | 第32页 |
| 3.2.7 产物萃取及HPLC检测条件 | 第32页 |
| 3.2.8 5L生物反应器发酵 | 第32-33页 |
| 3.2.9 制备液相条件 | 第33页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第33-41页 |
| 3.3.1 重组菌株GS-pksCT和GS-pksCT-npgA的构建 | 第33-36页 |
| 3.3.2 重组菌株GS-pksCT、GS-pksCT-npgA的诱导表达及转录鉴定 | 第36页 |
| 3.3.3 重组菌株GS-pksCT、GS-pksCT-npgA表达产物的HPLC鉴定 | 第36页 |
| 3.3.4 重组菌株GS-pksCT-npgA表达产物的LC-MS鉴定 | 第36-38页 |
| 3.3.5 5L生物反应器发酵 | 第38页 |
| 3.3.6 发酵液的分离纯化 | 第38-39页 |
| 3.3.7 菌株GS-pksCT-npgA表达产物的NMR鉴定 | 第39-41页 |
| 3.4 小结 | 第41-43页 |
| 第4章 基因簇内修饰功能基因表达菌株的构建及蛋白检测 | 第43-49页 |
| 4.1 前言 | 第43页 |
| 4.2 实验材料及方法 | 第43-44页 |
| 4.2.1 实验菌株与质粒 | 第43页 |
| 4.2.2 培养基与培养条件 | 第43页 |
| 4.2.3 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第43页 |
| 4.2.4 缓冲液 | 第43页 |
| 4.2.5 引物设计 | 第43-44页 |
| 4.2.6 毕赤酵母胞内蛋白的提取 | 第44页 |
| 4.2.7 SDS-PAGE及Western blot检测 | 第44页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第44-47页 |
| 4.3.1 带His标签的功能基因的载体构建 | 第44-45页 |
| 4.3.2 带His标签的功能基因的重组酵母菌株的构建 | 第45-46页 |
| 4.3.3 带His标签的酵母重组菌株的诱导表达及转录鉴定 | 第46页 |
| 4.3.4 SDS-PAGE及Western blot检测 | 第46-47页 |
| 4.4 本章小结 | 第47-49页 |
| 第5章 基因簇内修饰功能基因参与桔霉素合成途径的功能分析 | 第49-59页 |
| 5.1 前言 | 第49页 |
| 5.2 实验材料及方法 | 第49-50页 |
| 5.2.1 实验菌株与质粒 | 第49页 |
| 5.2.2 培养基与培养方法 | 第49页 |
| 5.2.3 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第49页 |
| 5.2.4 引物设计 | 第49-50页 |
| 5.2.5 酵母RNA的抽提及逆转录 | 第50页 |
| 5.2.6 产物萃取及HPLC检测条件 | 第50页 |
| 5.2.7 pH对桔霉素降解的影响 | 第50页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第50-57页 |
| 5.3.1 重组菌株GS-pksCT-npgA-B、GS-pksCT-npgA-BA、GS-pksCT-npgA-BAO的构建 | 第50-53页 |
| 5.3.2 重组菌株GS-pksCT-npgA-BA、GS-pksCT-npgA-BAO的诱导表达及转录鉴定 | 第53-54页 |
| 5.3.3 重组菌株GS-pksCT-npgA-B、GS-pksCT-npgA-BA、GS-pksCT-npgA-BAO表达产物的HPLC鉴定 | 第54页 |
| 5.3.4 pH对桔霉素降解的影响 | 第54-57页 |
| 5.3.5 重组菌株GS-pksCT-npgA-BAO的发酵控制(pH>4)及产物鉴定 | 第57页 |
| 5.4 本章小结 | 第57-59页 |
| 第6章 紫红曲霉桔霉素合成基因簇的完善及桔霉素的异源合成 | 第59-69页 |
| 6.1 前言 | 第59页 |
| 6.2 实验材料及方法 | 第59-60页 |
| 6.2.1 实验菌株与质粒 | 第59页 |
| 6.2.2 培养基与培养方法 | 第59页 |
| 6.2.3 主要分子生物学试剂及试剂盒 | 第59页 |
| 6.2.4 紫红曲霉RNA的抽提及cDNA的制备 | 第59页 |
| 6.2.5 引物设计 | 第59-60页 |
| 6.2.6 产物萃取及HPLC检测条件 | 第60页 |
| 6.2.7 桔霉素标准曲线的制备 | 第60页 |
| 6.3 实验结果与讨论 | 第60-68页 |
| 6.3.1 mp16、mp17基因的获得 | 第60-61页 |
| 6.3.2 质粒pPICZA-mp16、pPICZA-mp17的构建 | 第61-62页 |
| 6.3.3 质粒pAGG-mp167的构建 | 第62-63页 |
| 6.3.4 重组菌株GS-pksCT-npgA-BAO-mp167的构建 | 第63-64页 |
| 6.3.5 重组菌株GS-pksCT-npgA-BAO-mp167的诱导表达及转录鉴定 | 第64-65页 |
| 6.3.6 重组菌株GS-pksCT-npgA-BAO-mp167表达产物的HPLC鉴定 | 第65页 |
| 6.3.7 重组菌株GS-pksCT-npgA-BAO-mp167表达产物的LC-MS鉴定 | 第65-67页 |
| 6.3.8 重组菌株GS-pksCT-npgA-BA表达产物的再次鉴定 | 第67-68页 |
| 6.4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第7章 结论与展望 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 附录 | 第75页 |
