| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 第1章 引言 | 第12-32页 |
| 1.1 醋酸菌 | 第12-18页 |
| 1.1.1 醋酸菌的分类和应用 | 第12-13页 |
| 1.1.2 影响醋酸菌生长和代谢的主要因素 | 第13-14页 |
| 1.1.3 醋酸菌酿醋的机理 | 第14-15页 |
| 1.1.4 醋酸菌的耐酸机制 | 第15-18页 |
| 1.2 乙醇脱氢酶的研究 | 第18-20页 |
| 1.2.1 乙醇脱氢酶简介 | 第18页 |
| 1.2.2 乙醇脱氢酶与醋酸菌耐酸性关系的研究 | 第18-20页 |
| 1.3 酶的定向进化技术 | 第20-23页 |
| 1.3.1 易错PCR(error-prone PCR) | 第21-22页 |
| 1.3.2 DNA改组(DNA shuffling) | 第22-23页 |
| 1.3.3 交错延伸(stagger extension process, StEP) | 第23页 |
| 1.3.4 随机引物体外重组(random-priming in vitro recombination, RPR) | 第23页 |
| 1.4 生物信息学的发展与研究 | 第23-25页 |
| 1.4.1 生物信息学的发展及其研究领域 | 第23-24页 |
| 1.4.2 生物信息学重要的研究机构及数据库 | 第24页 |
| 1.4.3 生物信息学的主要研究内容 | 第24-25页 |
| 1.5 双精氨酸转运(Tat)系统 | 第25-30页 |
| 1.5.1 Tat ABC蛋白 | 第25-26页 |
| 1.5.2 Tat信号肽 | 第26-27页 |
| 1.5.3 Tat转运机制 | 第27-28页 |
| 1.5.4 Tat底物的校对监控系统 | 第28-29页 |
| 1.5.5 Tat系统在重组蛋白分泌表达中的应用 | 第29-30页 |
| 1.6 研究内容与意义 | 第30-32页 |
| 1.6.1 立论 | 第30页 |
| 1.6.2 研究内容与技术路线 | 第30-31页 |
| 1.6.3 研究意义 | 第31-32页 |
| 第2章 乙醇脱氢酶的生物信息学分析 | 第32-50页 |
| 2.1 材料与方法 | 第32-33页 |
| 2.1.1 材料 | 第32页 |
| 2.1.2 方法 | 第32-33页 |
| 2.2 结果与分析 | 第33-47页 |
| 2.2.1 AdhA的氨基酸序列的查找 | 第33-34页 |
| 2.2.2 不同醋酸菌中AdhA的氨基酸序列的比较 | 第34-35页 |
| 2.2.3 AdhA的信号肽预测与分析 | 第35-37页 |
| 2.2.4 AdhA的二级结构的预测与分析 | 第37-39页 |
| 2.2.5 巴氏醋杆菌Ab3的AdhA的三级结构的预测与分析 | 第39-40页 |
| 2.2.6 巴氏醋杆菌Ab3的AdhA的生物信息学剖析 | 第40-47页 |
| 2.3 本章小结 | 第47-50页 |
| 第3章 乙醇脱氢酶AdhA重组体的构建与表达 | 第50-68页 |
| 3.1 材料与方法 | 第51-54页 |
| 3.1.1 菌株和载体 | 第51页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第51-52页 |
| 3.1.3 培养基 | 第52页 |
| 3.1.4 引物 | 第52-53页 |
| 3.1.5 主要仪器和设备 | 第53-54页 |
| 3.2 实验方法 | 第54-61页 |
| 3.2.1 pUG6质粒的提取 | 第54页 |
| 3.2.2 氨芐青霉素抗性基因ampr的克隆 | 第54-55页 |
| 3.2.3 重组载体pET28a-Bla的构建 | 第55-56页 |
| 3.2.4 感受态细胞的制作 | 第56页 |
| 3.2.5 重组载体pET28a-Bla的转化 | 第56-57页 |
| 3.2.6 重组载体pET28a-Bla的鉴定 | 第57-58页 |
| 3.2.7 adhA基因的克隆 | 第58-59页 |
| 3.2.8 重组载体pET28a-Bla-adhA (pADH-Bla)的构建 | 第59-60页 |
| 3.2.9 重组载体pADH-Bla的转化 | 第60页 |
| 3.2.10 重组载体pADH-Bla的鉴定 | 第60-61页 |
| 3.2.11 E.coli BL21(DE3)重组菌中adhA-ampr的诱导表达与鉴定 | 第61页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第61-66页 |
| 3.3.1 重组载体pET28a-Bla的构建与筛选验证 | 第61-63页 |
| 3.3.2 重组载体pADH-Bla的构建 | 第63-64页 |
| 3.3.3 重组载体pADH-Bla的筛选与鉴定 | 第64-66页 |
| 3.3.4 E.coli BL21(DE3)/pADH-Bla重组菌的诱导表达 | 第66页 |
| 3.4 本章小结 | 第66-68页 |
| 第4章 突变文库的构建与筛选 | 第68-82页 |
| 4.1 材料与方法 | 第68-69页 |
| 4.1.1 菌株 | 第68-69页 |
| 4.1.2 培养基 | 第69页 |
| 4.1.3 引物 | 第69页 |
| 4.1.4 仪器与设备 | 第69页 |
| 4.2 实验方法 | 第69-75页 |
| 4.2.1 易错PCR模板的获取 | 第69-70页 |
| 4.2.2 易错PCR法定向进化adhA基因 | 第70-72页 |
| 4.2.3 突变重组表达载体的构建 | 第72-73页 |
| 4.2.4 E.coli BL21(DE3)重组菌中adhAep-ampr的诱导表达与鉴定 | 第73-75页 |
| 4.2.5 突变型AdhA的序列和突变位点分析 | 第75页 |
| 4.3 结果与分析 | 第75-81页 |
| 4.3.1 易错PCR条件的确定 | 第75-76页 |
| 4.3.2 突变载体pADHep-Bla的构建与鉴定 | 第76-77页 |
| 4.3.3 氨苄抗性浓度平板梯度筛选 | 第77-79页 |
| 4.3.4 重组菌的SDS-PAGE蛋白电泳结果 | 第79页 |
| 4.3.5 突变AdhA的序列分析和突变位点分析 | 第79-81页 |
| 4.4 本章小结 | 第81-82页 |
| 第5章 结论与展望 | 第82-84页 |
| 5.1 结论 | 第82页 |
| 5.2 展望 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 附录一 重组载体pET28a-Bla测序结果 | 第93-95页 |
| 附录二 重组载体pADH-Bla测序结果 | 第95-99页 |
