| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌及其表达系统概述 | 第12-13页 |
| 1.1.1 枯草芽孢杆菌概述 | 第12页 |
| 1.1.2 枯草芽孢杆菌表达系统概述 | 第12-13页 |
| 1.2 基因组编辑方法 | 第13-15页 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌基因组编辑方法 | 第13-14页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统 | 第14-15页 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌宿主菌的改造 | 第15-17页 |
| 1.3.1 蛋白酶的敲除 | 第15页 |
| 1.3.2 细胞自溶素浓度的改造 | 第15页 |
| 1.3.3 Dlt操纵子的改造 | 第15-16页 |
| 1.3.4 伴侣蛋白的表达 | 第16-17页 |
| 1.3.5 基因组删减 | 第17页 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌表达载体改造 | 第17-19页 |
| 1.4.1 启动子 | 第17-18页 |
| 1.4.2 信号肽 | 第18-19页 |
| 1.5 普鲁兰酶的概述 | 第19-20页 |
| 1.6 立题依据与研究意义 | 第20页 |
| 1.7 主要研究内容 | 第20-22页 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌中CRISPR/C_(as)9系统的建立和菌株生长性状的改造 | 第22-39页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 材料和方法 | 第22-32页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第22-24页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第24页 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 | 第24-25页 |
| 2.2.4 分子生物学操作 | 第25-31页 |
| 2.2.5 分析方法 | 第31-32页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第32-38页 |
| 2.3.1 CRISPR/C_(as)9基因编辑系统敲除质粒的构建 | 第32-33页 |
| 2.3.2 采用CRISPR/C_(as)9基因编辑系统敲除srfC基因 | 第33-35页 |
| 2.3.3 采用CRISPR/C_(as)9基因编辑系统敲除spoIIAC基因 | 第35-36页 |
| 2.3.4 采用CRISPR/C_(as)9基因编辑系统敲除nprE和aprE基因 | 第36-37页 |
| 2.3.5 采用CRISPR/C_(as)9基因编辑系统敲除amyE基因 | 第37-38页 |
| 2.3.6 本实验室筛选野生型枯草芽孢杆菌的改造 | 第38页 |
| 2.4 小结 | 第38-39页 |
| 第三章 双启动子表达载体的构建和模型酶的表达 | 第39-54页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 材料与方法 | 第39-46页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第39页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第39-40页 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 | 第40-42页 |
| 3.2.4 分子生物学操作 | 第42-44页 |
| 3.2.5 分析方法 | 第44-46页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第46-53页 |
| 3.3.1 通过单启动子优化提高β-CGTase的表达 | 第46-48页 |
| 3.3.2 通过双启动子优化提高β-CGTase的表达 | 第48-50页 |
| 3.3.3 采用双启动子PHpaII-PamyQ表达普鲁兰酶和α-CGTase | 第50-52页 |
| 3.3.4 重组菌WS5PUL3-L罐发酵培养 | 第52-53页 |
| 3.4 小结 | 第53-54页 |
| 第四章 蛋白酶的敲除和普鲁兰酶发酵条件优化 | 第54-69页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 材料与方法 | 第54-58页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第54-55页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第55页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第55-56页 |
| 4.2.4 分子生物学操作 | 第56-58页 |
| 4.2.5 分析方法 | 第58页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第58-68页 |
| 4.3.1 六种胞外蛋白酶的敲除 | 第58页 |
| 4.3.2 普鲁兰酶、α-CGTase和β-CGTase在敲除菌WS11中的表达 | 第58-60页 |
| 4.3.3 重组菌WS11PUL3-L罐发酵培养 | 第60页 |
| 4.3.4 重组菌WS11PUL发酵条件优化 | 第60-68页 |
| 4.4 小结 | 第68-69页 |
| 第五章 蛋白酶对普鲁兰酶表达的影响及发酵补料优化 | 第69-81页 |
| 5.1 引言 | 第69页 |
| 5.2 材料和方法 | 第69-72页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第69-70页 |
| 5.2.2 试剂和仪器 | 第70-71页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第71页 |
| 5.2.4 分子生物学操作 | 第71页 |
| 5.2.5 重组普鲁兰酶的纯化 | 第71-72页 |
| 5.2.6 分析方法 | 第72页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第72-79页 |
| 5.3.1 蛋白酶在摇瓶发酵时对普鲁兰酶表达的影响 | 第72-73页 |
| 5.3.2 蛋白酶在3-L罐发酵时对普鲁兰酶表达的影响 | 第73-75页 |
| 5.3.3 不同蛋白酶浓度下普鲁兰酶样品的纯化、动力学参数和聚集状态的测定 | 第75-76页 |
| 5.3.4 不同蛋白酶浓度下普鲁兰酶样品的热稳定性 | 第76页 |
| 5.3.5 宿主菌WS3、WS9和WB600蛋白表达差异 | 第76-78页 |
| 5.3.6 通过优化补料培养基提高普鲁兰酶酶活 | 第78-79页 |
| 5.4 小结 | 第79-81页 |
| 第六章 增加细胞壁负电荷和优化信号肽提高普鲁兰酶表达研究 | 第81-102页 |
| 6.1 前言 | 第81页 |
| 6.2 材料与方法 | 第81-89页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第81-83页 |
| 6.2.2 试剂和仪器 | 第83-84页 |
| 6.2.3 培养基和培养条件 | 第84页 |
| 6.2.4 分子生物学操作 | 第84-88页 |
| 6.2.5 分析方法 | 第88-89页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第89-100页 |
| 6.3.1 伴侣蛋白对普鲁兰酶表达的影响 | 第89-93页 |
| 6.3.2 dltB基因的敲除对普鲁兰酶表达的影响 | 第93-95页 |
| 6.3.3 lytC基因的敲除对普鲁兰酶表达的影响 | 第95-97页 |
| 6.3.4 信号肽对普鲁兰酶表达的影响 | 第97-99页 |
| 6.3.5 重组菌WS9DPUL/ywtF和WS9DLPUL/ywtF3-L罐发酵培养 | 第99-100页 |
| 6.4 小结 | 第100-102页 |
| 主要结论与展望 | 第102-105页 |
| 论文主要创新点 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-113页 |
| 附录1 ：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第113-114页 |
| 附录2 ：启动子序列 | 第114-116页 |
