| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-27页 |
| 1.1 L-正缬氨酸概述 | 第12-18页 |
| 1.1.1 L-正缬氨酸的理化特性 | 第12页 |
| 1.1.2 L-正缬氨酸的生产方法 | 第12-17页 |
| 1.1.3 L-正缬氨酸的主要应用 | 第17-18页 |
| 1.2 生物催化剂概述 | 第18-20页 |
| 1.2.1 生物催化剂的立体选择性氧化和不对称还原 | 第19-20页 |
| 1.2.2 生物催化剂合成手性化合物 | 第20页 |
| 1.3 多酶级联催化体系 | 第20-23页 |
| 1.3.1 多酶级联催化体系的应用 | 第21-22页 |
| 1.3.2 多酶级联催化体系的分类和形式 | 第22页 |
| 1.3.3 多酶级联催化体系的优化 | 第22-23页 |
| 1.4 关键酶分子改造 | 第23-25页 |
| 1.4.1 酶分子改造的方法 | 第23页 |
| 1.4.2 甲酸脱氢酶的分子改造 | 第23-24页 |
| 1.4.3 D-氨基酸氧化酶的分子改造 | 第24-25页 |
| 1.5 课题的研究意义和主要内容 | 第25-27页 |
| 1.5.1 研究意义 | 第25页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 L-正缬氨酸多酶级联体系的构建及转化 | 第27-45页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 材料与方法 | 第27-36页 |
| 2.2.1 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.2.3 菌株、质粒及引物 | 第29-31页 |
| 2.2.4 培养基成分 | 第31页 |
| 2.2.5 重组质粒和菌株的构建 | 第31-33页 |
| 2.2.6 重组菌株的发酵培养 | 第33-34页 |
| 2.2.7 酶活测定方法及蛋白质浓度测定 | 第34-35页 |
| 2.2.8 蛋白纯化及SDS-PAGE电泳 | 第35页 |
| 2.2.9 多酶级联体系的制备 | 第35页 |
| 2.2.10 L-正缬氨酸转化及条件优化 | 第35-36页 |
| 2.2.11 L-正缬氨酸的分批转化 | 第36页 |
| 2.2.12 底物和产物检测 | 第36页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第36-44页 |
| 2.3.1 重组菌多酶级联表达体系的构建 | 第36-37页 |
| 2.3.2 重组菌的酶表达分析 | 第37-38页 |
| 2.3.3 5L发酵罐中重组菌培养及诱导表达 | 第38-39页 |
| 2.3.4 L-正缬氨酸多酶级联体系转化条件优化 | 第39-41页 |
| 2.3.5 L-正缬氨酸分批转化过程 | 第41-44页 |
| 2.4 本章小结 | 第44-45页 |
| 第三章 理性设计二硫键提高甲酸脱氢酶的稳定性 | 第45-57页 |
| 3.1 引言 | 第45页 |
| 3.2 材料与方法 | 第45-49页 |
| 3.2.1 主要仪器和试剂 | 第45页 |
| 3.2.2 菌株、质粒及引物 | 第45-46页 |
| 3.2.3 定点突变 | 第46-47页 |
| 3.2.4 培养基配方 | 第47页 |
| 3.2.5 突变体酶的表达和纯化 | 第47页 |
| 3.2.6 突变体酶二硫键形成的检测 | 第47-48页 |
| 3.2.7 突变体酶酶学性质研究 | 第48页 |
| 3.2.8 突变体酶动力学参数研究 | 第48页 |
| 3.2.9 突变体酶的分子动力学模拟 | 第48页 |
| 3.2.10 突变体酶三维结构分析 | 第48-49页 |
| 3.2.11 L-正缬氨酸分批转化 | 第49页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第49-56页 |
| 3.3.1 二硫键位点设计 | 第49页 |
| 3.3.2 突变体的构建和表达 | 第49页 |
| 3.3.3 突变体酶的纯化与二硫键验证 | 第49-51页 |
| 3.3.4 突变体酶的酶学性质研究 | 第51-52页 |
| 3.3.5 突变体酶动力学参数研究 | 第52-53页 |
| 3.3.6 突变体酶分子动力学模拟 | 第53-54页 |
| 3.3.7 突变体酶三维结构分析 | 第54-55页 |
| 3.3.8 L-正缬氨酸的分批转化验证 | 第55-56页 |
| 3.4 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 N-端修饰提高D-氨基酸氧化酶的表达酶活 | 第57-72页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 材料与方法 | 第57-62页 |
| 4.2.1 主要仪器和试剂 | 第57页 |
| 4.2.2 菌株、质粒及引物 | 第57-60页 |
| 4.2.3 培养配方 | 第60页 |
| 4.2.4 重组质粒和菌株的构建 | 第60页 |
| 4.2.5 重组菌的发酵与诱导表达 | 第60-61页 |
| 4.2.6 重组酶的活性和含量的测定 | 第61-62页 |
| 4.2.7 细胞生物量测定 | 第62页 |
| 4.2.8 L-正缬氨酸分批转化 | 第62页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第62-70页 |
| 4.3.1 D氨基酸氧化酶的N-端序列分析 | 第62-63页 |
| 4.3.2 N-端第二个氨基酸的重要性 | 第63-64页 |
| 4.3.3 N-端组氨酸个数调控可溶性表达 | 第64-65页 |
| 4.3.4 N-端无序区域替换 | 第65-66页 |
| 4.3.5 突变体酶的分批发酵 | 第66-67页 |
| 4.3.6 突变体酶的三维结构分析 | 第67-68页 |
| 4.3.7 含突变体酶的多酶级联体系的构建及发酵 | 第68-69页 |
| 4.3.8 L-正缬氨酸的分批转化验证 | 第69-70页 |
| 4.4 本章小结 | 第70-72页 |
| 第五章 多酶级联体系转化数学模型的构建 | 第72-83页 |
| 5.1 引言 | 第72页 |
| 5.2 材料与方法 | 第72-73页 |
| 5.2.1 主要仪器和试剂 | 第72页 |
| 5.2.2 酶活测定方法 | 第72页 |
| 5.2.3 动力学参数检测 | 第72-73页 |
| 5.2.4 微积分方程组求解 | 第73页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第73-81页 |
| 5.3.1 多酶级联体系转化过程速率分析 | 第73-74页 |
| 5.3.2 数学模型建立 | 第74-75页 |
| 5.3.3 动力学参数 | 第75-78页 |
| 5.3.4 模型的准确性验证 | 第78-79页 |
| 5.3.5 模型预测 | 第79-81页 |
| 5.4 本章小结 | 第81-83页 |
| 第六章 L-正缬氨酸多酶级联体系的优化及放大转化 | 第83-96页 |
| 6.1 引言 | 第83页 |
| 6.2 材料与方法 | 第83-86页 |
| 6.2.1 主要仪器和试剂 | 第83页 |
| 6.2.2 菌株、质粒及引物 | 第83-85页 |
| 6.2.3 酶活测定方法 | 第85页 |
| 6.2.4 L-正缬氨酸分批转化 | 第85页 |
| 6.2.5 辅酶添加量测定 | 第85页 |
| 6.2.6 初始底物添加来量测定 | 第85页 |
| 6.2.7 L-正缬氨酸分批补料转化 | 第85页 |
| 6.2.8 L-正缬氨酸放大转化 | 第85-86页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第86-95页 |
| 6.3.1 重组菌中FDH的表达优化及发酵 | 第86-88页 |
| 6.3.2 5L发酵罐中重组菌培养及诱导表达 | 第88页 |
| 6.3.3 L-正缬氨酸的分批转化验证 | 第88-89页 |
| 6.3.4 多酶级联体系的稀释优化 | 第89-91页 |
| 6.3.5 底物投料优化 | 第91-92页 |
| 6.3.6 L-正缬氨酸的分批补料转化 | 第92-94页 |
| 6.3.7 L-正缬氨酸转化放大 | 第94-95页 |
| 6.4 本章小结 | 第95-96页 |
| 主要结论与展望 | 第96-98页 |
| 主要结论 | 第96-97页 |
| 展望 | 第97-98页 |
| 论文创新点 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-110页 |
| 附录 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第110-111页 |
| 附图 | 第111页 |