| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 引言 | 第9-23页 |
| 1.1 立题背景及目的 | 第9页 |
| 1.2 小肠结肠炎耶尔森氏菌的简介 | 第9-11页 |
| 1.2.1 小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物学性状 | 第9-11页 |
| 1.2.2 小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要毒力因子及流行病学特征 | 第11页 |
| 1.3 检测小肠结肠炎耶尔森氏菌常用的方法 | 第11-13页 |
| 1.3.1 传统培养方法 | 第12-13页 |
| 1.3.2 分子生物学方法 | 第13页 |
| 1.4 环介导等温扩增(LAMP)技术 | 第13-22页 |
| 1.4.1 LAMP 的特点 | 第14-15页 |
| 1.4.2 LAMP 方法的引物设计[56] | 第15-17页 |
| 1.4.3 LAMP 法的理论基础 | 第17-20页 |
| 1.4.5 实时荧光 LAMP 反应的防污染措施 | 第20-21页 |
| 1.4.6 实时荧光 LAMP 监测仪 | 第21-22页 |
| 1.5 本课题主要研究内容 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-33页 |
| 2.1 试验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 试验用菌株 | 第23-24页 |
| 2.1.2 仪器设备 | 第24页 |
| 2.1.3 试验用培养基 | 第24-25页 |
| 2.1.4 样品与生化试剂 | 第25页 |
| 2.2 试验方法 | 第25-26页 |
| 2.2.1 小肠结肠炎耶尔森氏菌的培养 | 第25页 |
| 2.2.2 提取小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组 DNA | 第25-26页 |
| 2.3 实时荧光 LAMP 主要操作程序 | 第26-27页 |
| 2.3.1 设计实时荧光 LAMP 引物 | 第26页 |
| 2.3.2 实时荧光 LAMP 主要操作 | 第26-27页 |
| 2.4 实时荧光 LAMP 反应条件优化 | 第27-28页 |
| 2.4.1 引物对实时荧光 LAMP 反应的影响 | 第27页 |
| 2.4.2 反应温度的优化 | 第27-28页 |
| 2.4.3 Mg2+优化 | 第28页 |
| 2.4.4 dNTPs 浓度的优化 | 第28页 |
| 2.4.5 BstDNA 聚合酶的优化 | 第28页 |
| 2.4.6 甜菜碱对实时荧光 LAMP 反应的影响 | 第28页 |
| 2.4.7 10×BstDNA 聚合酶缓冲液的优化 | 第28页 |
| 2.5 引物特异性的检测 | 第28-29页 |
| 2.5.1 实时荧光 LAMP 引物特异性的检测 | 第28-29页 |
| 2.5.2 PCR 引物特异性的检测 | 第29页 |
| 2.6 验证小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度 | 第29-30页 |
| 2.6.1 实时荧光 LAMP 检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度 | 第29页 |
| 2.6.2 PCR 检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度 | 第29-30页 |
| 2.7 判断 LAMP 扩增反应方法 | 第30页 |
| 2.7.1 LAMP 反应实时荧光监测仪图谱分析 | 第30页 |
| 2.7.2 LAMP 结果酶切分析 | 第30页 |
| 2.8 比较提取人工污染鸡肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组 DNA 的方法 | 第30-32页 |
| 2.8.1 热裂解法 | 第30-31页 |
| 2.8.2 酚-氯仿抽提法 | 第31页 |
| 2.8.3 试剂盒法 | 第31-32页 |
| 2.9 人工污染鸡肉的检出限 | 第32-33页 |
| 2.9.1 人工污染鸡肉 | 第32页 |
| 2.9.2 实时荧光 LAMP 法检测人工污染小肠结肠炎耶尔森氏菌样品的检出限 | 第32-33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-48页 |
| 3.1 实时荧光 LAMP 反应条件的优化 | 第33-40页 |
| 3.1.1 引物缺省试验 | 第33页 |
| 3.1.2 引物间比例优化 | 第33-34页 |
| 3.1.3 反应温度优化 | 第34-36页 |
| 3.1.4 Mg2+优化 | 第36-37页 |
| 3.1.5 dNTPs 优化 | 第37-38页 |
| 3.1.6 Bst 酶优化 | 第38页 |
| 3.1.7 甜菜碱对实时荧光 LAMP 反应的影响 | 第38-39页 |
| 3.1.8 10×BstDNA 聚合酶缓冲液优化 | 第39-40页 |
| 3.1.9 实时荧光 LAMP 反应的最佳反应体系 | 第40页 |
| 3.2 引物特异性的研究 | 第40-42页 |
| 3.2.1 实时荧光 LAMP 引物特异性的检测 | 第40-41页 |
| 3.2.2 PCR 引物特异性的检测 | 第41-42页 |
| 3.3 小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度检测 | 第42-44页 |
| 3.3.1 平板菌落计数法测定小肠结肠炎耶尔森氏菌的浓度 | 第42-43页 |
| 3.3.2 实时荧光 LAMP 法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度 | 第43页 |
| 3.3.3 PCR 检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度 | 第43-44页 |
| 3.4 实时荧光 LAMP 扩增产物的分析 | 第44-45页 |
| 3.5 鸡肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌 DNA 提取方法比较 | 第45-46页 |
| 3.6 人工污染鸡肉检出限比较 | 第46-48页 |
| 4 讨论 | 第48-51页 |
| 4.1 实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌方法学评价 | 第48页 |
| 4.2 实时荧光环介导等温扩增(LAMP)引物的确定 | 第48-49页 |
| 4.3 DNA 聚合酶 | 第49页 |
| 4.4 实时荧光 LAMP 体系优化 | 第49-50页 |
| 4.5 实时荧光 LAMP 方法进一步开展深入研究内容的建议 | 第50-51页 |
| 5 结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 作者简介 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
