| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-29页 |
| 1.1 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第12-13页 |
| 1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展 | 第12页 |
| 1.1.2 毕赤酵母表达系统的优点 | 第12-13页 |
| 1.2 毕赤酵母中的启动子 | 第13-17页 |
| 1.2.1 AOX1启动子 | 第13-16页 |
| 1.2.2 其他诱导型启动子 | 第16页 |
| 1.2.3 组成型启动子 | 第16-17页 |
| 1.3 基于AOX1启动子的毕赤酵母表达系统 | 第17-20页 |
| 1.3.1 不同表型的毕赤酵母表达菌株 | 第17-18页 |
| 1.3.2 基于AOX1启动子的毕赤酵母表达系统的载体 | 第18-19页 |
| 1.3.3 基于AOX1启动子的毕赤酵母表达系统的改造 | 第19-20页 |
| 1.4 基于AOX1启动子的毕赤酵母表达系统的发酵过程 | 第20-22页 |
| 1.5 不同过程参数对毕赤酵母表达系统的影响 | 第22-24页 |
| 1.5.1 培养基成分的影响 | 第22页 |
| 1.5.2 温度的影响 | 第22-23页 |
| 1.5.3 pH的影响 | 第23-24页 |
| 1.5.4 溶解氧的影响 | 第24页 |
| 1.5.5 甲醇浓度的影响 | 第24页 |
| 1.6 基于AOX1启动子的毕赤酵母表达系统的不同诱导策略 | 第24-27页 |
| 1.6.1 根据在线的溶解氧调节甲醇补料速率 | 第25页 |
| 1.6.2 诱导阶段比生长速率对产量的影响 | 第25-26页 |
| 1.6.3 混合碳源补料对毕赤酵母发酵过程的影响 | 第26页 |
| 1.6.4 使用数学模型优化甲醇补料策略 | 第26-27页 |
| 1.6.5 采用恒化培养生产重组外源蛋白 | 第27页 |
| 1.7 本课题的研究目的及意义 | 第27-29页 |
| 第2章 新型非甲醇诱导毕赤酵母表达系统的菌体生长 | 第29-39页 |
| 2.1 前言 | 第29-30页 |
| 2.2 实验材料 | 第30-31页 |
| 2.2.1 菌株 | 第30页 |
| 2.2.2 摇瓶培养基和培养条件 | 第30页 |
| 2.2.3 发酵罐培养基 | 第30-31页 |
| 2.2.4 主要仪器设备及其他材料 | 第31页 |
| 2.3 实验方法 | 第31-33页 |
| 2.3.1 摇瓶中生长曲线的测定 | 第31页 |
| 2.3.2 L生物反应器培养 | 第31-32页 |
| 2.3.3 菌体湿重的检测 | 第32-33页 |
| 2.3.4 比生长速率的计算 | 第33页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第33-38页 |
| 2.4.1 突变株摇瓶中的生长 | 第33-35页 |
| 2.4.2 突变株在发酵罐中的分批及补料培养 | 第35-38页 |
| 2.5 本章小结 | 第38-39页 |
| 第3章 新型非甲醇诱导人胰岛素前体表达菌株MF1-IP的构建 | 第39-48页 |
| 3.1 前言 | 第39页 |
| 3.2 实验材料 | 第39-41页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第39-40页 |
| 3.2.2 摇瓶培养基和培养条件 | 第40页 |
| 3.2.3 生物化学或分子生物学试剂 | 第40-41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-43页 |
| 3.3.1 G418抗性基因的消除 | 第41页 |
| 3.3.2 胰岛素表达菌株的构建 | 第41-42页 |
| 3.3.3 胰岛素菌株在摇瓶中的发酵 | 第42页 |
| 3.3.4 高效液相色谱检测胰岛素前体 | 第42页 |
| 3.3.5 毕赤酵母感受态制备及电转化 | 第42-43页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第43-47页 |
| 3.4.1 新型毕赤酵母表达系统表达人胰岛素前体的菌株构建 | 第43-46页 |
| 3.4.2 胰岛素在摇瓶中的发酵表达 | 第46-47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-48页 |
| 第4章 MF1-IP表达人胰岛素前体的无甲醇诱导新工艺开发 | 第48-78页 |
| 4.1 前言 | 第48-49页 |
| 4.2 实验材料 | 第49页 |
| 4.2.1 菌株 | 第49页 |
| 4.2.2 发酵罐培养基 | 第49页 |
| 4.2.3 主要仪器设备及其他材料 | 第49页 |
| 4.3 实验方法 | 第49-55页 |
| 4.3.1 用葡萄糖浓度控制PAOX1的启动 | 第49-51页 |
| 4.3.2 发酵过程参数优化实验 | 第51页 |
| 4.3.3 诱导策略探索 | 第51-52页 |
| 4.3.4 发酵工艺中的耗氧和产热测定 | 第52-53页 |
| 4.3.5 OUR及k_La的计算 | 第53-54页 |
| 4.3.6 黏度的测定 | 第54页 |
| 4.3.7 蛋白质浓度的测定 | 第54页 |
| 4.3.8 恒化培养 | 第54-55页 |
| 4.3.9 半连续补料培养 | 第55页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第55-76页 |
| 4.4.1 用葡萄糖浓度控制P_(AOX1)的启动 | 第55-58页 |
| 4.4.2 发酵过程参数优化 | 第58-63页 |
| 4.4.3 诱导策略比较 | 第63-67页 |
| 4.4.4 耗氧和产热比较 | 第67-71页 |
| 4.4.5 发酵液的黏度 | 第71-76页 |
| 4.5 本章小结 | 第76-78页 |
| 第5章 MF1-IP表达人胰岛素前体的其他工艺探索 | 第78-90页 |
| 5.1 前言 | 第78-79页 |
| 5.2 实验材料 | 第79页 |
| 5.3 实验方法 | 第79-80页 |
| 5.3.1 葡萄糖补料速率的优化 | 第79页 |
| 5.3.2 甲醇恒化培养 | 第79页 |
| 5.3.3 甲醇补料速率的优化 | 第79-80页 |
| 5.3.4 计算方法 | 第80页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第80-88页 |
| 5.4.1 MF1-IP菌株不同葡萄糖补料速率的优化 | 第80-81页 |
| 5.4.2 利用甲醇诱导MF1-IP菌株生产人胰岛素前体 | 第81-88页 |
| 5.5 本章小结 | 第88-90页 |
| 第6章 结论、创新点与展望 | 第90-93页 |
| 6.1 主要结论 | 第90-92页 |
| 6.2 创新点 | 第92页 |
| 6.3 展望 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文与专利 | 第104页 |
