| 目录 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-15页 |
| Abstract | 第15-22页 |
| 缩略词表 | 第22-24页 |
| 第一章 研究背景与立题依据 | 第24-52页 |
| ·研究背景 | 第24-49页 |
| ·深海生态环境及其氮循环机制 | 第24-25页 |
| ·深海生态环境 | 第24页 |
| ·深海氮循环机制 | 第24-25页 |
| ·蛋白酶的定义和分类 | 第25-27页 |
| ·蛋白酶的定义 | 第25-26页 |
| ·蛋白酶的分类 | 第26-27页 |
| ·丝氨酸蛋白酶 | 第27-34页 |
| ·丝氨酸蛋白酶的分类 | 第28-29页 |
| ·丝氨酸蛋白酶的结构 | 第29-32页 |
| ·丝氨酸蛋白酶的催化机制 | 第32-33页 |
| ·枯草杆菌蛋白酶 | 第33-34页 |
| ·胶原蛋白与胶原蛋白酶 | 第34-47页 |
| ·胶原蛋白的结构与种类 | 第34-38页 |
| ·胶原蛋白的生物降解 | 第38-42页 |
| ·基质金属蛋白酶 | 第42-46页 |
| ·细菌胶原蛋白酶 | 第46-47页 |
| ·深海沉积物中参与PON和DON降解的产蛋白酶细菌及其所产的蛋白酶 | 第47-49页 |
| ·立题依据与研究内容 | 第49-52页 |
| ·立题依据 | 第49-50页 |
| ·研究内容 | 第50-52页 |
| 第二章 适冷蛋白酶MCP-01及其结构域的异源表达及分离纯化 | 第52-74页 |
| ·引言 | 第52页 |
| ·材料和方法 | 第52-60页 |
| ·菌株与质粒 | 第52-53页 |
| ·主要试剂、药品和试剂盒 | 第53页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第53-54页 |
| ·数据库及分析软件 | 第54-55页 |
| ·培养基的配制 | 第55页 |
| ·菌株的培养 | 第55-56页 |
| ·蛋白酶MCP-01及其结构域的基因克隆与表达 | 第56-58页 |
| ·Pseudoalteromonas.sp.SM9913基因组DNA的提取 | 第56页 |
| ·蛋白酶的基因克隆 | 第56页 |
| ·基因片段的回收 | 第56页 |
| ·基因片段的酶切和连接 | 第56-57页 |
| ·基因片段的转化 | 第57页 |
| ·重组转化子的筛选和鉴定 | 第57-58页 |
| ·重组酶在E.coli B121(DE3)中的重组表达 | 第58页 |
| ·重组蛋白酶的分离纯化 | 第58-59页 |
| ·变性聚丙烯酰胺电泳SDS-PAGE | 第59页 |
| ·蛋白酶浓度的测定 | 第59-60页 |
| ·蛋白酶活性的测定 | 第60页 |
| ·结果与分析 | 第60-71页 |
| ·重组酶MCP-01在E.coli中的异源表达 | 第60-63页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第60-61页 |
| ·MCP-01在E.coli中的重组表达 | 第61-63页 |
| ·MCP-01催化结构域(CD)在E.coli B121中的异源表达与分离纯化 | 第63-68页 |
| ·重组表达载体的构建及在E.coli中的重组表达 | 第63-65页 |
| ·重组酶CD产酶条件的优化 | 第65-67页 |
| ·重组酶CD的分离纯化 | 第67-68页 |
| ·PKD结构域在E.coli中的异源表达与分离纯化 | 第68-71页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第68-69页 |
| ·重组蛋白PKD在E.coli中的表达和分离纯化 | 第69-71页 |
| ·讨论 | 第71-74页 |
| 第三章 适冷蛋白酶MCP-01对胶原蛋白的催化性质研究 | 第74-90页 |
| ·引言 | 第74-75页 |
| ·材料和方法 | 第75-79页 |
| ·菌株与质粒 | 第75页 |
| ·主要分子试剂和试剂盒 | 第75页 |
| ·主要生化试剂与药品 | 第75-76页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第76页 |
| ·菌株的培养 | 第76页 |
| ·蛋白酶的分离纯化 | 第76-77页 |
| ·蛋白酶的活性测定 | 第77-78页 |
| ·鱼胶原蛋白的提取 | 第78页 |
| ·蛋白样品N端测序 | 第78-79页 |
| ·结果与分析 | 第79-87页 |
| ·MCP-01的底物特异性分析 | 第79-80页 |
| ·MCP-01对不可溶胶原蛋白的切割位点分析 | 第80-83页 |
| ·温度和pH对MCP-01胶原酶活的影响 | 第83-84页 |
| ·金属离子和蛋白酶抑制剂对MCP-01胶原酶活的影响 | 第84-86页 |
| ·结构域缺失突变体对MCP-01胶原酶活性的影响 | 第86-87页 |
| ·讨论 | 第87-90页 |
| 第四章 MCP-01的C端PKD结构域的胶原蛋白结合功能研究 | 第90-114页 |
| ·引言 | 第90-91页 |
| ·材料和方法 | 第91-93页 |
| ·菌株与质粒 | 第91页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第91页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第91页 |
| ·重叠延伸PCR | 第91-92页 |
| ·圆二色谱检测PKD及其突变体的结构 | 第92页 |
| ·荧光光谱检测检测PKD-EGFP的荧光强度 | 第92页 |
| ·扫描电镜观察 | 第92页 |
| ·原子力显微镜观察 | 第92-93页 |
| ·胶原蛋白二级结构检测 | 第93页 |
| ·胶原蛋白T_m值检测 | 第93页 |
| ·结果与分析 | 第93-110页 |
| ·PKD结构域与绿色荧光蛋白的融合表达 | 第93-95页 |
| ·PKD结构域与不可溶底物的结合功能研究 | 第95-98页 |
| ·PKD结构域与胶原蛋白结合的关键位点分析 | 第98-103页 |
| ·PKD结构域与其它胶原蛋白结合结构域的比较 | 第98-99页 |
| ·PKD结构域的同源模建 | 第99页 |
| ·PKD结构域突变体的构建 | 第99-102页 |
| ·突变体的胶原蛋白结合能力分析 | 第102-103页 |
| ·PKD结构域对胶原纤维束的膨胀作用 | 第103-105页 |
| ·PKD结构域对胶原纤维结构造成的变化 | 第105-108页 |
| ·SEM观察PKD结构域结合后对胶原纤维结构的变化 | 第105-106页 |
| ·SEM观察PKD结构域结合后对胶原纤维结构的变化 | 第106-107页 |
| ·PKD的结合对胶原表面电荷的影响 | 第107-108页 |
| ·PKD的膨胀作用对胶原三螺旋结构的影响 | 第108-110页 |
| ·讨论 | 第110-114页 |
| 第五章 MCP-01催化结构域的晶体结构及其催化机制的研究 | 第114-134页 |
| ·引言 | 第114-115页 |
| ·材料与方法 | 第115-119页 |
| ·菌株与质粒 | 第115页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第115页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第115页 |
| ·数据库及分析软件 | 第115-116页 |
| ·结晶前蛋白样品的处理 | 第116页 |
| ·蛋白晶体的培养及优化 | 第116页 |
| ·晶体衍射数据收集 | 第116-117页 |
| ·衍射数据的处理 | 第117页 |
| ·CD晶体与胶原蛋白小肽的分子共模拟 | 第117页 |
| ·CD的点突变体构建 | 第117-119页 |
| ·结果与分析 | 第119-132页 |
| ·CD蛋白样品的纯化和浓缩 | 第119-120页 |
| ·晶体衍射数据收集及处理 | 第120-121页 |
| ·相位的确定和模型的构建与修正 | 第121-122页 |
| ·CD结构模型质量分析 | 第122-123页 |
| ·CD整体结构的描述 | 第123-125页 |
| ·CD与Subtilisin Carlsberg的分子结构比较 | 第125-127页 |
| ·CD与胶原蛋白相互作用的分子模拟 | 第127-129页 |
| ·CD与胶原蛋白相互作用的关键氨基酸残基预测 | 第129-130页 |
| ·CD突变体的构建及性质分析 | 第130-132页 |
| ·讨论 | 第132-134页 |
| 第六章 适冷蛋白酶MCP-01的肉类嫩化作用和嫩化机制 | 第134-146页 |
| ·引言 | 第134-135页 |
| ·材料和方法 | 第135-138页 |
| ·主要生化试剂与材料 | 第135页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第135页 |
| ·菌株的培养 | 第135页 |
| ·蛋白酶的分离纯化 | 第135页 |
| ·蛋白酶浓度的测定 | 第135-136页 |
| ·肌原纤维蛋白的提取 | 第136页 |
| ·蛋白酶的活性测定 | 第136页 |
| ·蛋白酶处理牛肉的方法 | 第136-137页 |
| ·剪切力的测定 | 第137页 |
| ·保水性分析 | 第137页 |
| ·肌原纤维小片化指数(MFI)的测定 | 第137页 |
| ·扫描电镜观察 | 第137-138页 |
| ·结果与分析 | 第138-144页 |
| ·不同酶在低温下的嫩化效果 | 第138-140页 |
| ·酶处理前后牛肉的MFI指数分析 | 第140-141页 |
| ·MCP-01与商品化嫩化酶的底物特异性比较 | 第141页 |
| ·肌原纤维蛋白酶谱分析 | 第141-143页 |
| ·扫描电镜观察酶处理后肌肉组织的嫩化 | 第143-144页 |
| ·讨论 | 第144-146页 |
| 全文总结与展望 | 第146-148页 |
| 参考文献 | 第148-162页 |
| 在读期间论文发表、专利申请以及获奖情况 | 第162-164页 |
| 致谢 | 第164-165页 |
| 附录 | 第165-180页 |
| 学位论文评阅及答辩情祝表 | 第180页 |
