| 摘要 | 第7-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 缩略词表(ABBREVIATION) | 第15-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-51页 |
| 1.1 N-乙酰神经氨酸概述 | 第17-18页 |
| 1.2 NeuAc的合成与降解 | 第18-23页 |
| 1.2.1 NeuAc的合成途径 | 第18-22页 |
| 1.2.2 NeuAc的降解途径 | 第22-23页 |
| 1.3 NeuAc的生产 | 第23-30页 |
| 1.3.1 天然产物提取法 | 第23-24页 |
| 1.3.2 化学合成法 | 第24-25页 |
| 1.3.3 酶法合成 | 第25-27页 |
| 1.3.4 全细胞生物催化 | 第27-29页 |
| 1.3.5 微生物发酵法 | 第29-30页 |
| 1.4 不同来源酶的筛选 | 第30-34页 |
| 1.4.1 NeuAc醛缩酶 | 第30-31页 |
| 1.4.2 GlcNAc 2-异构酶 | 第31-32页 |
| 1.4.3 NeuAc合成酶 | 第32-34页 |
| 1.5 生物传感器概述 | 第34-36页 |
| 1.6 基于转录因子的传感器 | 第36-43页 |
| 1.6.1 TF传感器用于酶的筛选 | 第36-37页 |
| 1.6.2 TF传感器用于代谢工程 | 第37-41页 |
| 1.6.3 TF传感器设计 | 第41-43页 |
| 1.7 基于RNA的传感器 | 第43-49页 |
| 1.7.1 RNA传感器的设计 | 第43-48页 |
| 1.7.2 RNA传感器的应用 | 第48-49页 |
| 1.8 本论文的研究内容及意义 | 第49-51页 |
| 第二章 理性设计优化N-乙酰神经氨酸生产菌株 | 第51-79页 |
| 2.1 实验材料 | 第51-59页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第51-55页 |
| 2.1.2 培养基和主要试剂 | 第55-57页 |
| 2.1.2.1 培养基 | 第55-56页 |
| 2.1.2.2 主要试剂和缓冲液 | 第56-57页 |
| 2.1.3 分子生物学常用酶 | 第57页 |
| 2.1.4 常用试剂盒 | 第57页 |
| 2.1.5 常用生化试剂 | 第57-58页 |
| 2.1.6 仪器和设备 | 第58-59页 |
| 2.2 实验方法 | 第59-66页 |
| 2.2.1 菌种保藏 | 第59页 |
| 2.2.2 PCR扩增 | 第59-60页 |
| 2.2.3 CaCl_2法制备感受态细胞 | 第60页 |
| 2.2.4 CaCl_2法制备的感受态细胞转化 | 第60-61页 |
| 2.2.5 酶切连接构建质粒pB | 第61-62页 |
| 2.2.6 pAglk的构建 | 第62页 |
| 2.2.7 pBglnA的构建 | 第62页 |
| 2.2.8 pIn-T7P整合质粒的构建 | 第62-63页 |
| 2.2.9 电转化法敲除大肠杆菌基因 | 第63-64页 |
| 2.2.9.1 电转化感受态细胞的制备 | 第63页 |
| 2.2.9.2 敲除片段的获得 | 第63-64页 |
| 2.2.9.3 电转化 | 第64页 |
| 2.2.9.4 阳性克隆的筛选和重组质粒的去除 | 第64页 |
| 2.2.9.5 抗性基因的去除 | 第64页 |
| 2.2.10 重组大肠杆菌发酵生产NeuAc | 第64-65页 |
| 2.2.11 检测方法 | 第65-66页 |
| 2.3.11.1 发酵过程中糖浓度的测定 | 第65页 |
| 2.2.11.2 细菌生长情况检测 | 第65页 |
| 2.2.11.3 副产物的检测 | 第65页 |
| 2.2.11.4 NeuAc的检测 | 第65-66页 |
| 2.3 实验结果 | 第66-77页 |
| 2.3.1 间苯二酚法测定NeuAc的标准曲线 | 第66页 |
| 2.3.2 NeuAc生产菌株DN5/pNnsGM限制性因素分析 | 第66-70页 |
| 2.3.3 构建NeuAc合酶催化的合成途径 | 第70-72页 |
| 2.3.4 菌株PEP代谢途径改造 | 第72-74页 |
| 2.3.5 提高NeuAc生产的其它尝试 | 第74-75页 |
| 2.3.6 1L发酵罐条件优化 | 第75-77页 |
| 2.4 本章小结 | 第77-79页 |
| 第三章 N-乙酰神经氨酸生物传感器的构建及菌株进化 | 第79-107页 |
| 3.1 实验材料及方法 | 第79-93页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第79-84页 |
| 3.1.2 培养基和试剂 | 第84-85页 |
| 3.1.3 质粒构建 | 第85-88页 |
| 3.1.3.1 pS-gfp的构建 | 第85-86页 |
| 3.1.3.2 pS-tetA的构建 | 第86页 |
| 3.1.3.3 p-gfp和p-tetA的构建 | 第86页 |
| 3.1.3.4 pE-rs-gusA的构建 | 第86页 |
| 3.1.3.5 pSA和pSB的构建 | 第86-87页 |
| 3.1.3.6 RBS突变体文库的构建 | 第87页 |
| 3.1.3.7 NeuB突变体文库的构建 | 第87-88页 |
| 3.1.3.8 NeuB突变体的pET28a表达质粒构建 | 第88页 |
| 3.1.4 培养条件 | 第88-90页 |
| 3.1.4.1 以sfgfp为报告基因的功能验证 | 第88页 |
| 3.1.4.2 以tetA为报告基因的功能验证 | 第88-89页 |
| 3.1.4.3 NeuAc传感器在植物乳杆菌中的功能验证 | 第89页 |
| 3.1.4.4 模拟筛选 | 第89页 |
| 3.1.4.5 RBS文库及突变体酶的筛选 | 第89-90页 |
| 3.1.4.6 双阶段发酵 | 第90页 |
| 3.1.5 蛋白表达及分离纯化 | 第90-91页 |
| 3.1.5.1 菌体培养 | 第90页 |
| 3.1.5.2 蛋白纯化 | 第90-91页 |
| 3.1.6 SDS电泳凝胶配制及蛋白检测 | 第91-92页 |
| 3.1.6.1 相关试剂 | 第91-92页 |
| 3.1.6.2 Glycine-SDS-PAGE胶配制 | 第92页 |
| 3.1.6.3 蛋白检测 | 第92页 |
| 3.1.7 荧光测定及胞内NeuAc定量 | 第92-93页 |
| 3.1.8 蛋白质含量的测定 | 第93页 |
| 3.1.9 NeuB酶活测定 | 第93页 |
| 3.2 实验结果 | 第93-105页 |
| 3.2.1 构建NeuAc响应的核糖开关 | 第93-97页 |
| 3.2.2 模拟筛选验证传感器的可用性 | 第97-99页 |
| 3.2.3 基于传感器的NeuAc代谢途径优化 | 第99-103页 |
| 3.2.4 基于传感器的NeuAc合酶进化 | 第103-105页 |
| 3.3 本章小结 | 第105-107页 |
| 创新性成果与展望 | 第107-108页 |
| 创新性成果 | 第107页 |
| 展望 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-125页 |
| 致谢 | 第125-127页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第127-128页 |
| 外文写作 | 第128-129页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第129页 |
